VSMC marker基因α-SMA的新調節機制
背景
神經調節蛋白1（neuregulin-1, NRG-1）是神經調節蛋白家族成員之一。NRG-1蛋白結構上含有表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）樣的胞外結構域和高度保守的胞內結構域（intracellular domain, NRG-1-ICD）。NRG-1被基質金屬蛋白酶水解後釋放出具有生物活性的EGF胞外段；胞內段NRG-1-ICD則進入細胞核，通過與一些轉錄因子相互作用而調節基因表達；此外，NRG-1-ICD含有的LIM結構域還參與和胞漿蛋白的相互作用。許多研究表明，NRG-1在心血管生理及病理過程中都發揮重要作用。血小板源性生長因子BB（platelet-derived growth factor BB, PDGF-BB）能夠刺激血管平滑肌細胞（VSMCs）去分化成合成型表型，使細胞增殖和遷移增加；而TGF-β1能夠維持細胞分化呈收縮表型。在VSMCs中，NRG-1可抑制由PDGF-BB引起的細胞增殖和遷移。但是，TGF-β1誘導的VSMC分化是否需要NRG-1-ICD參與以及NRG-1-ICD如何調節VSMCs的功能目前尚無報道。
環狀RNA（circular RNA, circRNA）是一種對真核基因表達具有調節功能的共價、閉合、單鏈RNA。circRNA可作為微小RNA（micro RNA，miRNA）的「海綿」競爭性結合胞內miRNA，阻斷miRNA對其靶基因的抑制作用，從而上調miRNA靶基因的表達。除此以外，circRNA也可通過與RNA結合蛋白(RNA-binding protein， RBP）結合，或者與其他RNA通過鹼基互補結合而對特定基因發揮調節作用。目前關於描述VSMC中的circRNA表達調控和生物學功能的信息很少。本研究基於以上基礎，以TGF-β1作為VSMC分化的誘導因素，首次證明NRG-1-ICD誘導的circRNA——circACTA2，通過與miR-548f-5p相互作用，從而釋放miR-548f-5p對α-SMA的抑制作用。
結果
1. TGF-β1誘導VSMCs產生NRG-1，其胞內結構域參與細胞骨架組織
NRG-1 在正常動脈組織和 VSMC 細胞中表達豐富，而在內膜增生狀態下表達減少（圖1A，B）。WB 結果顯示 TGF-β1以時間依賴性的方式上調NRG-1蛋白表達（圖1C）。TGF-β1 處理後的 VSMCs 上清中，NRG-1β（NRG-1 的可溶性生物活性形式）增加，但 PDGF-BB 不影響 NRG-1β 水平（圖1D，Online Figure IIE）。結果表明 TGF-β1 不僅誘導 NRG-1 表達，而且促進其被蛋白水解酶切割成活性形式。
接下來，在HASMCs細胞中用腺病毒過表達NRG-1，結果發現NRG-1可以促進肌動蛋白絲（actin filaments, F-actin）募集成肌動蛋白束，且能抵抗細胞鬆弛素（CB）誘導的解聚（圖1E），表明NRG-1參與F-actin的形成並穩定其結構。作者進一步探究發現用NRG-1β處理細胞不影響肌動蛋白細胞骨架（Online Figure IIIA），但是過表達NRG-1-ICD細胞骨架則出現束狀排列（Online Figure IIIB），表明NRG-1通過其ICD域介導細胞骨架組織。
進一步探究NRG-1-ICD參與細胞骨架的組織是否依賴於NRG-1-ICD與α-SMA的相互作用。免疫熒光結果顯示，TGF-β1 刺激HASMC 細胞後NRG-1-ICD 和 α-SMA的表達水平均上升，且共定位（Online Figure IVC）。免疫共沉澱，GST pull-down ，鄰位連接技術（PLA）等實驗結果進一步證實， TGF-β1 促進了NRG-1/NRG-1-ICD 和 α-SMA的結合（Online Figure IVA，IVB，圖 1G）。這些發現表明 TGF-β1 可以直接促進NRG-1-ICD 與α-SMA 相互作用從而參與細胞骨架組織。
2. NRG-1-ICD通過與α-SMA基因的第一內含子結合而上調α-SMA表達
在TGF-β1處理後的細胞中觀察到NRG-1-ICD發生明顯的核易位（圖1H）。結合染色質免疫沉澱測序（ChIP-seq），有65個與NRG-1-ICD差異結合的基因，α-SMA基因（也稱為ACTA2）屬於14個上調的基因之一（Online Figure VA）。對ChIP-Seq結果進行驗證，結果發現TGF-β1促進α-SMA基因內含子區與NRG-1-ICD的結合（圖1I）。構建NRG-1-ICD-binding site和NRG-1-ICD-binding site mut熒光素酶報告基因載體，與NRG-1-ICD表達質粒共轉染後，觀察到野生型NRG-1-ICD-binding site活性明顯升高（Online Figure VC）。這些結果表明，NRG-1-ICD與α-SMA基因第一內含子區+5642 bp/+5787 bp結合（Online Figure VB）。NRG-1-ICD的過表達和敲低實驗顯示，NRG-1-ICD增加TGF-β1誘導後α-SMA的表達（圖1J）。過表達鼠源NRG-1-ICD可以回復人VSMC敲降NRG-1-ICD後的表型（Online Figure VG），進一步明確 NRG-1-ICD通過與α-SMA基因的第一內含子結合而上調α-SMA表達。
NRG-1-ICD誘導新的circRNA，即circACTA2的形成：作者查閱資料庫，發現α-SMA基因座可以產生4個α-SMA circRNA，而NRG-1-ICD 過表達不影響α-SMA mRNA 水平且能與α-SMA基因的第一內含子結合，推測NRG-1-ICD可能通過誘導circRNA生成上調α-SMA表達。驗證發現擴增不出已知的4個α-SMA circRNA，但是他們發現一條全新的長度為730bp的circACTA2。
作者設計針對circACTA2的引物，以cDNA和基因組DNA為模板進行RT-PCR。結果顯示， cDNA模板可以擴增出circACTA2，而gDNA模板則不能擴增出此片段（Online Figure VIA）。RNase R降解線性RNA後，α-SMA mRNA水平顯著降低，對circACTA2的影響較小（Online FigureVIB）。northern印跡進一步證明了circACTA2來源於α-SMA基因的5號外顯子至9號外顯子的環化（圖2A）。這些結果鑒定circACTA2為一個新的環狀RNA
為了研究NRG-1-ICD是否可以影響circACTA2的形成：研究者用CRISPR interference（CRISPRi）技術，合成一段與NRG-1-ICD結合位點互補的單鏈gRNA，它通過介導 Cas9 酶切割α-SMA 基因第一內含子而阻斷轉錄。結果顯示，切斷NRG-1-ICD結合位點後，circACTA2表達降低，而α-SMA mRNA沒有變化（圖2C）。TGF-β1和NRG-1-ICD單獨或聯合過表達增加circACTA2的表達，而NRG-1-ICD敲降消除了TGF-β誘導的circACTA2上調（圖2D， Online Figure VIJ）。這些研究結果表明NRG-1-ICD通過與α-SMA基因的第一個內含子結合而介導circACTA2形成。
3. NRG-1-ICD通過募集IKZF1至α-SMA基因的第一內含子，誘導circACTA2形成
研究者通過生物素標記pull-down實驗來尋找HASMC中與NRG-1-ICD結合序列相互作用的蛋白質，轉錄因子Ikzf1（Ikaros）、PHB2和ASCC3被募集。免疫共沉澱、兩步法ChIP和PLA等實驗顯示，在TGF-β1處理的細胞中Ikzf1與NRG-1-ICD相互作用，TGF-β1增加了它們的相互作用（圖2E-G，Online Figure VIIA）。這些結果表明NRG-1-ICD與Ikzf1形成穩定的複合物。
為了研究RNA結合蛋白Quaking（QKI）和RNA編輯酶ADAR1是否參與TGF-β誘導的circACTA2形成，研究者發現TGF-β1/NRG-1-ICD影響了QKI/ADAR1的表達，說明二者可能參與NRG-1-ICD誘導的circACTA2形成。（圖2H）。QKI或ADAR1敲降後，circACTA2形成分別減少或增加，但α-SMA mRNA水平未受影響（圖2I和2J）。這些數據表明QKI和ADARI影響NRG-1-ICD誘導的circACTA2形成。
4.circACTA2通過減少miR-548f-5p來上調α-SMA
為了確定α-SMA的表達和circACTA2之間的關係，我們設計兩個siRNA，一個特異性敲低circACTA2（si-circACTA2），另一個是同時敲低環狀和線狀ACTA2（si-both）。結果發現，si-circACTA2不影響α-SMA mRNA水平；si-both時，會使circACTA2和α-SMA mRNA的水平均下降（Online Figure IXA）。在HASMC中，過表達或敲除circACTA2顯著影響了α-SMA蛋白的表達（圖3A）。表明circACTA2在TGF-β1/ NRG-1-ICD誘導的α-SMA表達中起重要作用，且circACTA2可能通過轉錄後水平調節α-SMA表達。
circACTA2與miR-548f-5p有相互作用：RNAhybrid和miRanda-based預測circACTA2能與miR-548f-5p互補結合。螢光素酶測定表明miR-548f-5p mimic顯著降低由野生型circACTA2序列介導的螢光素酶活性（Online Figure IXE）。生物素標記的pull-down實驗發現，二者相互富集（圖3B和3C）。RNA原位雜交的結果發現circACTA2與miR-548f-5p共定位（圖3D）。在內膜增生的腎動脈中，miR-548f-5p水平顯著增加（圖3E），而circACTA2表達及其與miR-548f-5p的相互作用在內膜增生的動脈中減少（圖3F和3G）。人circACTA2過表達不能減少小鼠股動脈損傷引起的內膜增生（Online Figure XA and XB），可能由於circACTA2具有物種特異性。
α-SMA是miR-548f-5p靶基因：人α-SMA 3"-UTR含有miR-548f-5p-結合位點。螢光素酶測定證實了miR-548f-5p與α-SMA 3"-UTR的結合（圖3H）。miR-548f-5p mimic和anti-miR-548f-5p降低或增加α-SMA蛋白表達（圖3I）。TGF-β1刺激和 NRG-1-ICD 過表達都可以使 miR-548f-5p 的表達水平降低，二者聯合時降低更為顯著（圖3J）。這些結果表明，circ ACTA2 可以作為分子「海綿」吸附 miR-548f-5p。
5. NRG-1-ICD / circACTA2 / miR-548f-5p軸調節HASMC收縮
si-circACTA2顯著降低NRG-1-ICD過表達誘導的α-SMA表達，反之亦然（圖4A）。miR-548f-5p沉默或circACTA2表達的變化影響α-SMA表達（圖4C）故circACTA2和miR-548f-5p是NRG-1-ICD誘導α-SMA表達的關鍵介質。
過表達circACTA2或NRG-1-ICD、以及沉默miR-548f-5p可以增加乙醯膽鹼（Ach）或去甲腎上腺素（NE）誘導的HASMC收縮（圖4B和4D，Online Figure XIIC和XIIF）。結果表明circACTA2作為miR-548f-5p的分子海綿促進α-SMA表達，影響細胞收縮。
參考文獻：
Sun Y, Yang Z, Zheng B, et al. A Novel Regulatory Mechanism of Smooth Muscle α-actin Expression by NRG-1/circACTA2/miR-548f-5p Axis[J]. Circulation Research, 2017, 121(6):CIRCRESAHA.117.311441.
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