南方醫科大學白曉春組發現酪氨酸激酶Fyn可以通過激活β-catenin通路促進關節炎

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引言

骨關節炎（OA）是一種年齡相關性或創傷後退行性關節病，具有關節軟骨的丟失，軟骨細胞的肥大分化，軟骨下骨重建，滑膜炎症和骨贅形成等特點。儘管已經被認知的危險因素，包括衰老，既往關節損傷，肥胖，遺傳，性別以及與關節形狀和對線有關的解剖學因素，OA的確切發病機制尚未明確。公認的致病性OA的機制包括基質降解酶（例如基質金屬蛋白酶（MMPs）和具有血小板反應蛋白基序的解聚素和金屬蛋白酶（ADAMTS），軟骨特異性細胞外基質（ECM）和軟骨細胞凋亡的降解。對於OA仍然沒有有效的疾病緩解治療，迫切需要治療其新葯。因此，了解控制軟骨細胞的機制肥大和調節ECM降解相關基因的表達對於開發OA的有效治療是重要的。

越來越多的數據表明，經典的WNT /β-catenin信號通路在調節OA發病機制中發揮重要作用。已經有報道，在退化的軟骨區域的軟骨細胞中β-catenin增加。成年小鼠關節軟骨細胞中β-catenin信號傳導的激活導致軟骨細胞過早分化和OA樣表型的發展。此外，激活β-catenin在成熟軟骨細胞中可以促進其肥大，基質礦化，MMP13和血管內皮生長因子的表達。但是，OA和軟骨退變過程中WNT /β-catenin被激活的機制尚未完全明確。在這項研究中，作者表明了在老年、創傷後OA小鼠和人OA軟骨的軟骨中Src家族激酶中非受體酪氨酸激酶Fyn增加。 Fyn直接磷酸化並穩定β-catenin，促進其核移位和活化，導致膠原蛋白X，MMP13和ADAMTS5的表達增強以及ECM的加速降解。因此，作者首次確定Fyn通過激活β-catenin信號轉導在OA中的關鍵作用，並為OA提供潛在的新型治療靶點。

概述

1. Fyn在老年、創傷後OA小鼠以及OA患者的關節軟骨中表達增加。

2. Fyn敲除後可以減緩老年和創傷後小鼠的關節炎發展。

3. Fyn與磷酸化（Tyr142）相互作用並穩定軟骨細胞中的β-catenin。

4. Fyn激活β-catenin途徑並促進OA發展。

5. Fyn抑製劑AZD0530和PP1抑制β-catenin信號傳導並延緩小鼠中的OA發展。

結論

1.在老年小鼠、創傷後的OA的小鼠以及OA患者的關節軟骨中Fyn表達增多。

OA與衰老密切相關，但這種聯繫的機制知之甚少。作者首先使用蛋白質組範圍篩選來鑒定蛋白質通過比較年輕（2月齡）和老齡（12月齡）小鼠的關節軟骨參與軟骨變性。 通過對5015個蛋白質鑒定，與年輕的小鼠相比，年老的小鼠關節軟骨中，303個蛋白質上調，115個蛋白質下調（> 1.5倍）。

其中，酪氨酸激酶Fyn，但不包括SFK家族的其他成員（包括Fgr，Lyn，Csk和Hck）是老年軟骨中最強烈的上調蛋白（12.47倍）。

然後作者通過蛋白免疫印跡試驗對4,13和24個月齡的小鼠的關節軟骨進行分析，證實了Fyn在老年小鼠的軟骨中明顯增加圖。

在年老的小鼠中，Fyn表達量伴隨著軟骨退變和國際骨關節炎研究協（OARSI）等級評分的增加而增加。免疫熒光染色證實Fyn在老年小鼠的關節軟骨細胞中累積。

然後，作者評估了手術誘導的創傷後OA小鼠模型中Fyn的表達。與作者先前的發現相一致，Fyn表達在基線未損傷的關節軟骨中低，但其水平在OA小鼠中顯著增加，同時軟骨損傷增加（DMM手術使內側半月板不穩定術後4周和8周。）

確定Fyn水平在人類OA關節軟骨中是否升高，作者比較了接受全膝關節置換的受試者的老年（67.00±3.03歲）OA軟骨和來自未患有骨關節炎病史的年輕（30.25±8.18歲）交通事故受害者的正常軟骨樣品中的Fyn表達的關節炎疾病。通過免疫熒光分析在老年和OA軟骨軟骨細胞中檢測到Fyn水平的顯著升高，以及OA軟骨中的退化和結構損失。

總之，作者的研究結果表明Src激酶家族成員Fyn在老年小鼠和OA患者的變性和受損關節軟骨中累積。

2. Fyn敲除可以減緩老年和創傷後小鼠的關節炎發展

為了確定Fyn在退化或受損軟骨的關節軟骨細胞中的積聚的重要性。作者使用來自傑克遜實驗室（Fyntm1Sor / J，庫存號012468）的Fyn敲除小鼠（Fyn-KO）。 總的來說，Fyn-KO小鼠比對照小鼠略小，它們的體重和肢長也略低。

用Fyn的免疫熒光染色和免疫蛋白質印跡在8周齡小鼠中證實Fyn在軟骨中的缺失。 驗證敲除成功。

Fyn-KO小鼠和8周齡的同窩對照小鼠之間在關節軟骨或生長板的形態或組織方面沒有明顯的差異。 這些結果表明Fyn的缺失不會引起骨骼發育異常在小鼠中。

作者接下來探究了Fyn缺失對創傷後和年齡相關OA的發展的影響。在6周齡的Fyn-KO小鼠和它們的同窩對照小鼠（對照）上進行DMM手術。對照組小鼠分別在術後4周和8周時出現中度和重度OA。有趣的是，Fyn-KO小鼠在DMM手術後4周和8周顯示軟骨退變程度顯著減少，OARSI等級明顯降低和減少滑膜炎症。

與對照組相比，Fyn-KO小鼠的軟骨中MMP13和ADAMTS5免疫組化，軟骨下骨組織中的軟骨細胞肥大標誌物膠原蛋白X和骨鈣蛋白的表達顯著降低。

此外，末端脫氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記（TUNEL）染色顯示在Fyn-KO小鼠的關節軟骨中凋亡軟骨細胞的數目顯著減少。

作者還注意到12個月大的Fyn-KO小鼠與對照小鼠相比軟骨降解減少。

總之，這些數據表明Fyn在OA發展中起作用，並且Fyn的喪失有效地延緩了小鼠中創傷後和年齡依賴性OA的發展。

3. Fyn與磷酸化（Tyr142）相互作用並穩定軟骨細胞中的β-catenin

為了探究Fyn促進OA發展的機制，作者將免疫沉澱（IP）與蛋白質組學分析相結合，以鑒定軟骨原代細胞系ATDC5中的Fyn相互作用蛋白。有趣的是，在純化的複合物中發現了β-catenin的肽序列，表明β-catenin是潛在的結合伴侶的Fyn。

β-catenin與Fyn之間的相互作用通過IP分析在ATDC5細胞，原代軟骨細胞和軟骨組織中證實。

β-catenin和Fyn的雙重染色也顯示β-catenin與ATDC5細胞中的Fyn共定位。

先前的研究已經證明酪氨酸激酶如Fyn磷酸化β-catenin在多個位點（包Tyr142）上並且促進E-鈣粘蛋白 - catenin複合物的解離，導致鈣粘蛋白介導的細胞 - 細胞粘附的喪失和細胞質β-catenin的增加。這代表了激活β-catenin信號的另一種機制。為了確定Fyn是否磷酸化軟骨細胞中的β-catenin，作者在ATDC5細胞中進行了體外Fyn激酶測定。如圖所示，Fyn在體外在Tyr142處磷酸化的β-catenin免疫沉澱，並且該磷酸化被Fyn激酶抑製劑PP1或AZD0530抑制。

重要的是，在ATDC5細胞中，通過用Fyn定向干擾RNA（siRNAs）沉默Fyn的表達，β-catenin及其磷酸化（Tyr142）的表達被減弱。

但是轉染由Fyn編碼的質粒後，Fyn過表達增強了β-catenin及其磷酸（Tyr142）的表達。

此外，Wnt標準靶標Axin2和LEF1的mRNA水平也隨著ATDC5細胞中Fyn的增加而增加，表明Fyn激活了β-catenin信號傳導。

為了驗證Fyn在β-連環蛋白信號傳導途徑中的關鍵作用，在ATDC5細胞中檢測了鈣粘蛋白 - 連環蛋白複合物的形成。 PP1對Fyn的抑制或siRNA對Fyn表達的下調穩定了鈣粘蛋白 - 連環蛋白複合物，而Fyn過表達破壞了複合物。

總之，這些數據表明Fyn與磷酸化（Tyr142）相互作用並穩定β-連環蛋白，引起軟骨細胞中鈣粘蛋白 - 連環蛋白複合物的解離。

4. Fyn激活β-catenin途徑並促進OA發展

為了評估Fyn在OA期間軟骨細胞中β-catenin信號轉導中的作用，作者在體外和體內雙重染色Fyn和β-catenin的軟骨細胞。當作者用增加量的Fyn編碼質粒（0,1或2μg）轉染ATDC5細胞時，作者觀察到β-catenin易位隨著Fyn水平的增加，從細胞膜到細胞核。

然後作者用促炎性因子白細胞介素1β（IL-1β; 0,10和20ng / mL）處理ATDC5細胞以模擬OA中ECM和蛋白聚糖的降解. IL-1β劑量依賴性地誘導在細胞的細胞質和細胞核中Fyn和β-catenin的積聚，並增加Fyn表達和磷酸化（Tyr416），β-catenin表達和磷酸化（Tyr142）和MMP13表達。

在IL-1β刺激的原代軟骨細胞中觀察到類似的結果

然後，作者評估了來自老年小鼠和創傷後OA的軟骨中β-catenin的水平及其磷酸化。正如預期的那樣，β-catenin及其磷酸化水平隨著老齡化和OA的惡化而增加。

與此相一致的是，Fyn和β-catenin的雙染色證實了老年小鼠和具有手術誘導的OA的小鼠的軟骨細胞中β-catenin的積聚和核易位。

此外，在創傷後Fyn-KO小鼠的關節軟骨細胞中β-catenin的水平及其核定位明顯低於對照小鼠。

Wnt3a是經典的WNT /β-catenin途徑的激活劑。沉默Fyn基因不會減少Wnt3a上調的β-catenin。

儘管WNT拮抗劑DKK-1或SFRP1阻止了Wnt3a誘導它們不影響ATDC5細胞中Fyn過表達引起的β-catenin的上調。

因此，作者的研究結果表明，Fyn激活獨立於Wnt信號傳導的β-catenin通路，並增強關節軟骨細胞中β-catenin核轉位OA的發展。

作者接下來研究了Fyn累積是否通過β-catenin途徑促進OA發展。 ICG-001是一種選擇性低分子量抑製劑，可以拮抗β-catenin / TCF介導的轉錄。ICG-001關節注射4或8周後，ICG-001治療顯著減少軟骨損傷，維持蛋白多糖在關節軟骨中的表達，並降低OA發展期間的關節炎等級。

在ICG-001注射後，退化的軟骨中MMP13和ADAMTS5的表達水平也相應降低。

隨後，作者檢測了Fyn，β-catenin抑製劑ICG-001和β-catenin激活劑SKL2001在IL-1β處理的ATDC5細胞中的作用。Fyn過表達強化了IL-1β對MMP13、ADAMTS5上調的作用，而ICG-001處理抵消了Fyn促進的由IL-1β誘導的兩種酶的表達。 SKL2001上調IL-1β刺激的軟骨細胞中MMP13和ADAMTS5的表達，沉默Fyn後減少。

這些結果證明β-catenin途徑促進了由Fyn刺激的軟骨細胞中的MMP13和ADAMTS5表達以及OA在小鼠中的發展。

5. Fyn抑製劑AZD0530和PP1抑制β-catenin信號傳導並阻礙小鼠中的OA發展。

為了研究Fyn作為OA治療靶點的潛在用途，作者研究了Fyn化學抑製劑對OA發病機制和進展的影響。 AZD0530（也稱為"saracatinib"）和PP1是Src激酶（包括Fyn）的選擇性抑製劑，用於治療癌症。這兩種化合物在轉染的ATDC5細胞中抑制Fyn的激酶活性並阻斷Fyn磷酸化（p-Fyn）用Fyn編碼質粒。

口服給予經DMM手術處理的C57BL / 6J小鼠AZD0530或每天腹腔注射PP1，術後4周收集關節。用AZD0530或PP1處理的小鼠與對照相比沒有顯著的副作用和死亡率增加。

如預計，AZD0530和PP1顯著降低軟骨軟骨細胞中的p-Fyn水平，證實其對Fyn的抑制作用。

值得注意的是，與對照組的小鼠相比，AZD0530和PP1處理顯著降低了軟骨，OARSI等級和滑膜炎症的破壞。

在抑製劑處理的小鼠中，MMP13， ADAMTS5和膠原蛋白X，軟骨下骨中TUNEL陽性軟骨細胞和骨鈣蛋白表達的數量也顯著減少。

這些結果表明，Fyn激酶活性的抑制阻止了該蛋白的激活小鼠創傷後OA的發展。

作者接下來確定AZD0530或PP1是否通過減少β-catenin的磷酸化來改善OA的進展。用IL-1β刺激後，用或不用AZD0530或PP1處理ATDC5細胞。如圖所示蛋白免疫印跡顯示由IL-1β刺激引起的MMP13和ADAMTS5的上調被AZD0530或PP1消除，並且p-β-catenin（Tyr142）的增加也被抑制。

作者用免疫熒光染色證實了p-β-catenin（Tyr142）的表達降低。

接下來作者檢測了表達式的β-catenin（Tyr142）在用或不用AZD0530或PP1治療的創傷性OA小鼠的軟骨樣品中的表達。 免疫蛋白印跡實驗證實AZD0530處理組和PP1處理的小鼠中MMP13和p-Fyn的表達降低並且p-β-catenin（Tyr142）的表達顯著降低。

作者還注意到Fyn和β-catenin在OA軟骨細胞核中的共定位信號被AZD0530或PP1治療後消除或者減弱。

人類OA軟骨與AZD0530或PP1的孵育也降低了軟骨細胞核中β-catenin的表達（圖H）。

總的來說，這些發現表明AZD0530和PP1通過抑制Fyn誘導的磷酸化β-catenin的表達來阻礙OA的發展。

討論

目前還沒有被許可的能夠緩解OA的有效的藥物。對OA發病機制的全面了解對開發特異性和有效藥物以預防和治療這種疾病至關重要。 SFKs在許多疾病中的作用已被包括癌症和神經系統疾病，因此它們正在成為新的藥理學靶點。然而，據作者所知，本研究首次證實了SFK家族成員Fyn在軟骨退變和發育中的重要作用。作者發現Fyn在老化小鼠的關節軟骨損傷的小鼠中累積。作者還發現，Fyn缺陷可保護小鼠免於年齡相關和創傷誘導的軟骨退化和OA的發展。重要的是，對Fyn的沉默或者AZD0530或PP1的化學抑制有效地阻止了小鼠OA的發展，這意味著Fyn可能是一種新的OA治療靶點，並且使用抑制Fyn激酶活性的藥物AZD0530和PP1可能會擴展到OA的治療。作者提出一種新的模式，其中Fyn激活β-catenin信號傳導，並且Fyn的積累和β-catenin的酪氨酸磷酸化和核易位在調節基質降解酶的表達和OA的發展。然而，OA和老年關節軟骨中Fyn積聚的機制仍有待確定。

關節軟骨細胞中β-catenin的激活構成了OA發育過程中正常關節軟骨細胞向終末分化軟骨細胞轉化的病理機制，OA與軟骨細胞成熟基因的活化和基質降解有關。然而，β-catenin活化的機制還不完全清楚。在典型的WNT /β-catenin途徑中，WNT信號傳導的激活導致抑制GSK-3β活性和β-catenin降解，導致細胞質（信號傳導）β-catenin的積聚。作者篩選Fyn-相互作用並且證明Fyn與Tyr142中的β-catenin相互作用並磷酸化，並在軟骨細胞中獨立於Wnt信號傳導穩定它。以前的研究表明酪氨酸激酶可磷酸化β-catenin，將其從鈣粘蛋白複合物中釋放出來並導致β-catenin在細胞質中的積聚，這代表了β-catenin信號傳導被激活的另一種機制。作者還證實Fyn磷酸化β-catenin，從而將其從軟骨細胞中的鈣粘蛋白複合物中釋放出來，導致β-catenin的積聚和核移位以及活化的軟骨細胞成熟基因和基質降解，促進OA的發展。該證據表明Fyn通過Wnt獨立機制激活β-catenin信號傳導以促進OA的發病機制和進展。

已建立的抑制OA發展的機制在很大程度上取決於抑制軟骨分解代謝的酶.作者發Fyn的敲除抑制了軟骨分解代謝酶的表達並減弱了小鼠中的OA。因此，有必要進一步研究Fyn的靶向抑制以預防和治療OA。 AZD0530（saracatinib）是SFK的抑製劑，阻斷Src具有低（納摩爾）效力並且還顯示針對Fyn的活性。它最初被開發用於治療各種類型的癌症，但由於其缺乏效力而在II期試驗中停止。 PP1被鑒定為Fyn的高效抑製劑，並作為ATP結合的競爭性抑製劑。目前，AZD0530和PP1主要在調查中治療實體瘤，肺癌和阿爾茨海默病.在這項研究中，作者已經證明，通過將Fyn與這兩種抑製劑相結合可以預防OA進展。此外，Fyn刺激的β-catenin的積聚和核易位也受到AZD0530和PP1的抑制。與OA相關的分解代謝酶和關節軟骨中的軟骨細胞凋亡在治療後明顯下降與任何抑製劑。這是關於SFKs在OA中的作用的第一篇報道，SFK和Fyn抑製劑的使用可能會成功擴展到其治療。

總之，在這項研究中，作者將Fyn確定為預防和治療OA的新靶點。作者還建立了Fyn，β-catenin和OA之間的聯繫，證明OA在關節軟骨細胞中積累的Fyn直接與β-catenin相互作用並磷酸化，促進其核易位並誘導OA相關基因表達。SFK抑製劑AZD0530和Fyn，PP1抑製劑延緩了OA的發展，因此是用於治療這種疾病的潛在藥物。

參考文獻：

Li K, Zhang Y, Zhang Y, et al. Tyrosine kinase Fyn promotes osteoarthritis by activating the β-catenin pathway[J]. Annals of the rheumatic diseases, 2018: annrheumdis-2017-212658.

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