犬貓流感病毒的研究進展
編者按
為展示中國動物傳染病領域內青年科學家的研究進展和成果，《中國動物傳染病學報》自2018年第1期起，推出特色專欄——「優秀青年學者論壇」。該論壇以綜述論文形式，為海內外優秀青年學者搭建學術交流平台，集中展現青年學者對所研究領域的分析見解及未來展望，將帶給大家更豐富的內容與更廣闊的視野。敬請關注！
作者簡介
孫怡朋，中國農業大學動物醫學院副教授，博士生導師。多年來一直從事動物流感病毒致病機制及防控技術的研究工作。以第一或通信作者在PNAS、JVI等SCI雜誌上發表論文22篇，累計影響因子90。獲批國家發明專利4項。系國家自然科學基金優秀青年科學基金、教育部青年長江學者項目、中國科協青年人才托舉工程、北京市科技新星等人才項目的獲得者。
A型流感病毒可以引起禽、人和豬等多種宿主的急性呼吸系統疾病，是一種世界範圍的重要病原微生物。A型流感病毒具有廣泛的宿主特異性，能導致多種宿主感染，根據感染宿主類型的不同，可將流感分為禽流感、豬流感、人流感、犬流感和貓流感等。早期人們認為A型流感病毒不能在自然條件下感染犬、貓，但後來各亞型流感病毒被相繼從具有呼吸道癥狀的病犬、貓中分離出來。
犬流感病毒
雖然早在20世紀60年代，犬腎細胞（madin-darby canine kidney, MDCK）就被用來培養各種流感病毒，但犬作為流感病毒宿主的作用還未被人們認識。1972年，Nikitin等首次證明，在實驗室條件下人H3N2病毒可以感染犬，並通過血清學調查證明犬在自然狀態下也能感染人H3N2病毒，但未能分離出病毒。直至2004年，人們才第一次從具有呼吸道癥狀的病犬中分離出H3N8亞型犬流感病毒（Canine influenza virus, CIV），之後又相繼分離出多種亞型流感病毒。犬成為繼豬、馬、禽之後的又一重要流感病毒宿主，其宿主作用及在流感病毒跨宿主傳播中的作用越來越受到關注。
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馬源H3N8亞型犬流感病毒
H3N8亞型犬流感病毒的流行情況2004年1月，在美國佛羅里達州的一個賽犬場里22隻賽犬爆發嚴重呼吸系統疾病，導致8隻賽犬死亡。對其中6隻病死賽犬進行病理剖檢，發現呼吸系統發生嚴重病變，表現為出血性支氣管炎、支氣管肺炎和胸膜炎。將這些病死犬的肺臟勻漿接種各系細胞，最終從MDCK中分離到1株犬流感病毒。經實驗室診斷髮現，分離到的病毒為H3N8亞型流感病毒，且其8個片段與馬H3N8流感病毒親緣性最高，達96%以上。在實驗室條件下，用H3N8流感病毒感染健康犬，同樣能引起犬的急性呼吸道癥狀，這表明H3N8亞型流感病毒是引起22隻賽犬爆發呼吸系統疾病的「幕後真兇」。H3N8亞型犬流感病毒成為從犬上分離得到的第一株流感病毒，也是H3N8流感病毒由馬向犬的跨物種傳播。
Anderson等對1984-2004年儲存的血清進行了回溯性調查發現，H3N8 CIV在1999年便開始在美國的賽犬中流行，但直到2004年才在收容犬和寵物犬中出現，之後廣泛流行於美國德克薩斯、佛羅里達、紐約、加利福尼亞等多個州，呈現明顯的地方流行性特徵。2005年以後，美國分離到的H3N8 CIV與H3N8馬流感病毒（Equine influenza viruses, EIV）都有很高的親緣性，但與2004年首次分離株相比，已形成新的獨立分支。目前，流行於美國的H3N8犬流感病毒在進化樹上已形成科羅拉多、賓夕法尼亞和紐約三大地域分支，表明H3N8亞型犬流感病毒在不同地域發生了相對獨立的適應進化。
總之，H3N8亞型流感病毒是從犬中分離到的第一種流感病毒，它是由H3N8 EIV傳播到犬後不斷進化而來。目前，該病毒主要在美國犬群中持續流行，並且已形成穩定譜系。雖然，在英國、澳大利亞也曾有關於H3N8亞型流感病毒被分離得到的報道，但未能持續流行。Zhou等通過HI和微量中和實驗，對2015年5月-2015年11月期間在中國廣州、深圳、北京和上海收集的寵物犬血清進行血清學調查，結果發現H3N8亞型流感病毒的血清學陽性率為0.83%，這是中國地區犬感染H3N8亞型流感病毒的首次報道。然而，目前為止中國犬群中並未分離到H3N8亞型流感病毒，表明該病毒在中國地區未能形成流行趨勢。
H3N8犬流感病毒的生物學特性雖然早期的研究表明，H3N8 EIV不能造成除馬以外的其他物種（包括人）的呼吸系統疾病，但2004年馬源H3N8 CIV在美國引起賽犬急性呼吸系統疾病的爆發。犬呼吸道中的鼻粘膜、氣管和支氣管纖毛上皮細胞上存在大量α-2，3唾液酸受體，因此H3N8 CIV主要感染犬的呼吸系統，引起一系列的呼吸系統疾病。犬感染H3N8亞型流感病毒後，輕者發熱、咳嗽，持續十數天後恢復健康；重犬表現出出血性支氣管炎、支氣管肺炎、胸膜炎，甚至急性死亡。通常在病犬支氣管、氣管上皮細胞和肺泡巨噬細胞中可檢測到病毒抗原，許多自然感染犬會繼發細菌性肺炎，死亡犬還會出現嚴重的肺出血並導致血胸。
H3N8亞型EIV可以引起馬的自然感染，並能從馬跨物種傳播給犬，但目前沒有證據表明H3N8 CIV能回傳給馬。儘管H3N8亞型CIV起源於H3N8亞型EIV，但兩者之間的生物學特性具有很大差異。它們的HA蛋白於都具有α-2，3唾液酸受體結合特性，但兩者HA基因並非完全相同，與H3N8 EIV相比，H3N8 CIV的HA序列主要發生了兩處變異，分別是位於受體結合區域的W222L和對於膜融合活性至關重要的T30S。儘管W222L並未徹底改變其受體結合特性，但這兩個突變可能促進了H3N8 CIV對犬的感染。早期的研究表明H3N8 EIV不能引起小鼠感染，但Castleman等發現，H3N8 CIV能有效感染小鼠，可見犬在H3N8亞型流感病毒的跨物種傳播中具有重要的中間宿主作用。
儘管目前為止沒有任何關於人感染H3N8犬流感病毒的報道，血清學調查也未在人血清中發現抗H3N8亞型流感病毒的抗體，但並能不排除該病毒可能會通過犬與人的密切接觸而感染人，因此有必要對犬流感病毒進行持續監測。
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禽源H3N8亞型犬流感病毒
H3N2亞型犬流感病毒的流行情況2007年5-9月，在韓國南部Kyunggi省和Jeolla省的幾個寵物診所和犬舍里多個品種的犬相繼爆發嚴重呼吸系統疾病，臨床表現為厭食、發燒、咳嗽和流涕等癥狀，部分病例後期病情加重導致死亡。Song等將病犬鼻分泌物接種11日齡雞胚進行病毒分離，3-4 d後收集尿囊液，進行RT-PCR擴增和序列測定，最終測序結果顯示，分離到的病毒為H3N2亞型流感病毒，其8個片段與禽源H3N2流感病毒進化關係最近，達95.5%-98.9%。在實驗室條件下，將分離到的H3N2流感病毒通過鼻腔接種方式感染健康的比格犬，同樣能引起犬的急性呼吸道癥狀，這表明H3N2亞型流感病毒是引起韓國呼吸系統疾病爆發的元兇。H3N2犬流感病毒成為從犬上分離得到的第二種流感病毒，這是完整H3N2亞型流感病毒由禽向犬的跨物種傳播。
2007年7-12月，Lee等對H3N2犬流感病毒在韓國犬群中的流行情況進行了血清學調查，共採集了829份血清樣本，結果發現犬群中H3N2犬流感病毒的血清陽性率高達19%,其中一犬場的血清陽性率更是達到了100%，表明H3N2犬流感病毒在韓國犬群中已經廣泛流行。他們通過ELISA、HI和微量中和實驗，對2004-2009年間韓國保存的犬血清進行了回溯性研究發現，其實早在2005年H3N2犬流感病毒就已經出現在韓國犬群中。
2006年5月-2007年10月，我國南方地區（廣東省）出現4例患嚴重呼吸系統疾病的病例，發病犬的臨床癥狀均表現為咳嗽、噴嚏、流涕和低燒（39.6℃-39.9℃）。Li等研究人員採集發病犬的鼻拭子，處理後接種SPF雞胚，結果分離出四株H3N2亞型流感病毒，經遺傳進化分析表明，這4株病毒的8個基因片段與2007年韓國首次分離的禽源H3N2犬流感病毒的親緣關係最近。此後，在中國遼寧省、北京市、黑龍江省、廣東省、浙江省和江蘇省等地區多次分離到H3N2亞型的犬流感病毒。同時，大量的血清學調查表明，H3N2 CIV在中國犬群（包括寵物犬，還有流浪犬和養殖場的犬）中已經廣泛流行。
2012年1月，泰國曼谷地區一家寵物醫院出現一例患呼吸道癥狀的病例，不久從該病犬中分離到1株H3N2犬流感病毒，序列比對表明，該株病毒與韓國、中國地區分離到的犬流感病毒的同源性最高。但此後，泰國地區未再出現H3N2犬流感病毒感染犬的相關報道。
2015年2-3月，禽源H3N2亞型CIV在美國芝加哥地區爆發，隨後的5個月內，美國中西部地區超過1000隻犬受到感染，其他23個州也相繼出現H3N2犬流感病毒感染犬的病例。全基因組測序結果顯示，2015年美國分離到的H3N2 CIV與韓國2015年分離到的H3N2 CIV親緣性最高，各基因片段核苷酸同源性達98%以上。序列分析表明，2015年流行於韓國的H3N2 CIV引入到美國，造成了本次H3N2 CIV疫情的爆發，這標誌著H3N2亞型CIV的流行區域已經由亞洲擴大到北美地區。最近的研究表明，美國不同州的H3N2 CIV在遺傳進化樹中呈現地域性差異。
H3N2犬流感病毒的生物學特性2007年，韓國首次出現H3N2 CIV，該病毒在感染犬後，能引起一系列呼吸系統疾病，並誘發嚴重的永久性肺炎，但不會引發肺以外的其他臟器感染。然而，Zeng等研究發現，將2010年中國江蘇省分離的H3N2 CIV接種犬後，誘發了廣泛的肺外感染，即除呼吸系統外，肝臟、脾臟、腎臟、腦和十二指腸等臟器均發生嚴重損傷並能檢測到病毒抗原。2015年芝加哥地區感染H3N2犬流感病毒的犬，喉、咽和氣管表面覆蓋一層纖維性滲出物，雙側肺部出現多發性胸膜壞死，出血，充血，肺水腫。
H3N2亞型流感病毒由禽跨物種傳播到犬，經歷了一個不斷適應性演變的過程。對H3N2犬流感病毒的HA和NA基因進行序列分析發現，與其禽源H3N2祖先病毒相比，H3N2犬流感病毒的HA基因有7處突變，6處位於HA1（T10A、D81N、L111I/V、A160T、D172N、W222L），1處位於HA2(D489N)。其中，HA1的D81N、A160T和G209S突變分別位於其E、B和D抗原位點處；W222L突變發生在其受體結合位點處，已有研究表明，此突變可以增強病毒對α-2，3唾液酸受體的結合性，可能因此加強了病毒對犬的感染；此外，T10A突變使其失去了一個潛在的糖基化位點，而D81N突變則增加了一個糖基化位點；在NA的抗原位點處也發生了一些突變。2007年及之前的毒株HA序列含有PEKQTR/G裂解位點基序；而2007年以後的毒株HA裂解位點基序則為PERQTR/G，其中2009年北京分離的一株病毒含有特殊的PERRTR/G裂解位點，該毒株的HA蛋白具有更強的裂解活性。2009年及之後毒株的NA莖部在74-75位點處有兩個氨基酸的插入，這些變異可能會改變病毒的生物學特性。
儘管H3N2亞型CIV起源於水禽，但目前沒有證據表明它能從病犬回傳給禽類，同樣實驗室條件下，它也不能通過鼻內接種的方式使雞或鴨等禽類感染。然而，H3N2亞型CIV卻能在小鼠、豚鼠和雪貂等哺乳動物的呼吸道有效複製，表明犬可能在禽流感病毒的跨物種傳播中發揮重要中間宿主作用。H3N2犬流感病毒不僅能在犬群間有效傳播，還能通過飛沫傳播從犬傳播給貓，並通過直接接觸感染雪貂。
H3N2亞型CIV對公共衛生健康的潛在威脅，不僅僅體現在其在犬間的廣泛流行和對犬的嚴重致病性，還在於它可能與其他亞型流感病毒發生重排，導致宿主範圍、病性等發生改變。2012年，韓國犬中分離到一株H1N1/09人流感病毒和禽源H3N2亞型CIV的重排病毒，該病毒的HA基因來自H3N2犬流感病毒，其餘7個基因片段由H1N1/09人流感病毒提供。同年，在韓國地區又相繼分離到H1N1/09大流行病毒和H3N2亞型CIV多種方式的重組病毒（如攜帶H1N1/09大流行病毒M基因的H3N2亞型CIV，攜帶H1N1/09大流行病毒PA、NS和M基因的H3N2亞型CIV等）。2017年，Sun等以pdmH1N1和H3N2 CIV為骨架，通過將這兩株病毒基因進行隨機重組，拯救出51株重組病毒，實驗證明相對於經典H3N2亞型CIV，這些重排病毒具有更強的（接觸）傳播能力、複製能力、致病性。CIV與人流感病毒的頻繁重排，暗示CIV可能會不斷朝著適應人的方向演化，進而產生能感染人的重排病毒，對公共安全造成威脅。
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其他犬流感病毒
目前，世界上流行的犬流感病毒主要為馬源H3N8 CIV和禽源H3N2 CIV兩種亞型，它們都呈地方流行性，其中H3N8 CIV主要流行於美國，而H3N2 CIV主要流行於亞洲地區，近期也有在美國流行的趨勢。除此之外，在犬上還相繼分離到其他多種亞型流感病毒，但都是散發個例，沒能形成流行趨勢。
2009年，一種新型H1N1人流感病毒席捲全球，造成大批人感染。同年，孫莎莎等在北京的寵物犬中也分離到2株大流行H1N1/09病毒，並通過實驗證明大流行H1N1/09病毒可以有效感染犬，但不能在犬群間有效傳播。2012-2013年，Sun等進行的血清學調查顯示，中國寵物犬群中，H3N2 CIV、H1N1/09和人H3N2流感病毒的血清學陽性率分別為3.5%，1.5%和1.2%，說明犬除了可以感染禽源H3N2 CIV外，還能感染人H3N2和H1N1/09亞型流感病毒。
2014年泰國的一隻犬在吃了感染高致病性H5N1流感病毒的鴨子後死亡，研究人員從其體內首次分離到H5N1流感毒株。同年在泰國曼谷進行的血清學調查發現，檢測的629份犬血清樣本中有160份表現為H5N1亞型流感病毒陽性，但並沒有找到H5N1亞型流感病毒在犬群中傳播的證據。除了H5N1亞型以外，2009年，在我國山東，一株重組H5N2亞型流感病毒從犬中分離出來，病毒的NA來源於H9N2禽流感病毒，而其他七個片段均來源於H5N1豬流感病毒。將H5N2 CIV感染犬，能誘發中度呼吸系統綜合症，對犬並不致死；且病毒可以通過直接接觸在犬群間傳播。H5N2 CIV不僅能在犬群內傳播，還能通過直接接觸將病毒傳播給雞和貓，且雞對H5N2 CIV更易感。
2010年1月-2011年12月，Sun等在廣西省多個寵物醫院和犬場的犬中，採集到588份鼻腔粘液樣本，處理後接種10日齡SPF雞胚，結果首次在犬上分離出13株H9N2亞型流感病毒。遺傳進化分析顯示，此病毒的八個基因片段分別來自5株H9N2禽流感病毒，表明該H9N2 CIV可能由禽傳播到犬。
貓流感病毒
研究發現，貓及貓科動物都對流感病毒十分易感，它們在食入感染過流感病毒的動物性食品或接觸感染過流感病毒的人畜禽後，很容易被感染，目前在貓及貓科動物身上已分離到多種亞型貓流感病毒（Feline influenza virus，FIV），包括H1N1、H5N1、H5N6及H7N2等。
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H5亞型貓流感病毒
2003-2004年，高致病性H5N1亞型流感病毒在東南亞地區爆發，不僅造成家禽的大批死亡，據官方報道還發生了39例鳥-人直接傳播事件，其中24例死亡。在這次疫情中，也有關於家貓和動物園貓科動物在吃了感染H5N1流感病毒的雞後發病死亡的報道。這徹底顛覆了之前人們關於家貓可以抵抗A型流感病毒感染的認識。
2004年2月，在泰國爆發高致病性H5N1禽流感期間，一隻家貓在吃過鴿子屍體5天後突然發病，表現為精神沉鬱，氣喘和41℃高燒，發病2d後表現出驚厥、共濟失調最終死亡。貓的屍檢顯示腦充血，結膜炎，肺水腫，嚴重肺炎，腎充血和腸漿膜出血等。將病死貓的組織研磨液接種雞胚，最終分離到1株H5N1亞型流感病毒，序列比對結果顯示，該病毒與死鴿上分離到的病毒一致，都屬於當時泰國流行的H5N1禽流感病毒，這表明FIV是直接通過食入方式由禽傳播而來。Kuiken等用H5N1禽流感病毒實驗室感染家貓，結果感染貓表現出類似的臨床癥狀，表明H5N1禽流感病毒確實可以感染家貓。
2014年5月，中國正式確認首例人感染H5N6型禽流感病毒。同年，在貓上分離到H5N6亞型流感病毒，遺傳進化分析表明該病毒來自禽（野鳥），但直到2016年才再次在貓身上分離到該亞型流感病毒。2016年，中國廣東省的幾隻流浪貓出現精神沉鬱、氣喘、高燒和昏睡癥狀，最終死亡。將病死貓的肺臟勻漿接種雞胚進行病毒分離，並使用RT-PCR病毒鑒定，測序結果顯示該病毒新型H5N6重組病毒，其基因組8片段分別來自H5N6、H9N2和H7N9流感病毒。研究表明該重組病毒具有更強的哺乳動物適應性，能在小鼠體內複製。
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HINI亞型貓流感病毒
2009年，新型四源重排豬源H1N1人流感病毒席捲全球，造成大批人感染。儘管該型病毒只在人間傳播，偶爾也會從感染的人傳播到易感動物（如豬、火雞和雪貂等）上，但一般認為它不會造成家養寵物的感染。然而，Sponseller等首次報道了家貓的H1N1感染，這引起各界人生的廣泛關注。
2009年，美國愛荷華州立大學勞埃德獸醫中心接診了一例精神沉鬱、食慾下降並患有呼吸道癥狀的病貓。據貓主人陳述，該貓在出現臨床癥狀之前，3名家庭成員中的兩名曾經歷過一種以發熱、咳嗽和肌痛為特徵的上呼吸道疾病，4-6 d後該貓發病。Sponseller等從該貓的支氣管肺泡灌洗液中分離到1株H1N1流感病毒，序列比對發現該毒株與美國2009年人流感大流行分離株的同源性最高，其中HA、NA、M基因的同源性分別達到99.4%、99.4%和99.8%。
Lohr等首次報道了大流行H1N1/2009流感病毒引起家貓發生致死性呼吸道疾病的案例。2009年，美國俄勒岡州1隻10歲的雄性短毛貓和1隻8歲的雌性短毛貓，在患嚴重呼吸道疾病不久後死亡。病理剖檢發現，兩隻貓的肺葉呈瀰漫性實變和不完全性塌陷。組織學檢測發現，兩隻貓都表現為中度到重度的壞死性支氣管間質性肺炎。最終，它們的鼻分泌物和肺勻漿中分離到兩株A型流感病毒，經RT-PCR鑒定和測序發現，該病毒為大流行H1N1/2009流感病毒。
血清學調查表明，貓中A型流感感染的血清陽性率可能高於預期。2009-2010年，美國俄勒岡州進行的血清學調查發現，家貓中大流行H1N1/2009流感病毒、季節性H1N1流感病毒、H3N2流感病毒的血清陽性率分別達22.5%、33%和43.5%。而2012-2013年，中國東北地區進行的血清學調查發現，該地區的1255隻貓中大流行H1N1/2009流感病毒的血清陽性達21％。
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其他亞型貓流感病毒
Kim等研究發現禽源H3N2犬流感病毒不僅能在犬群間有效傳播，還能通過飛沫傳播從犬傳播給貓，並通過直接接觸感染雪貂。2010年在韓國的家貓和流浪貓中都分離到H3N2亞型CIV。Zhou等2010-2012年在中國南方地區進行的血清學調查和Zhang等2010-2014年在中國北方地區進行的血清學調查表明，活禽市場的流浪貓和家庭寵物貓血清中含有H3N2 CIV的抗體。這些均暗示了貓可能是H3N2 CIV從犬傳播給貓科動物的一個中間宿主。
隨著更多亞型FIV（如低致病性H7N2亞型流感病毒於2016年在首次美國的貓上被分離到）被從貓上分離到，貓在流感病毒傳播中的作用越來越受人們關注。
綜上所述
犬、貓在流感病毒傳播中的中間宿主作用越來越突出，很多以前被認為不會突破種間屏障感染哺乳動物的流感病毒相繼被從犬貓上分離到。此外，犬、貓在流感病毒遺傳演化過程中的「混合器」作用越來越明顯，各亞型犬、貓流感病毒間及犬、貓流感病毒與人流感病毒間的頻繁重排，產生多種危害更大的重排病毒，增加了其對公共衛生健康的危害。隨著經濟、貿易全球化進程的不斷推進，原本只呈區域性流行的犬、貓流感病毒，逐漸突破地理屏障，傳播到世界各地，極大增加了流感病毒全球化流行的風險。鑒於犬、貓與人的親密接觸性，犬、貓流感病毒在犬、貓群體間的廣泛流行及不斷演化，對公共衛生健康產生潛在威脅，各國應加強流行病學調查,對犬、貓流感病毒的流行情況進行實時檢測，降低大規模爆發的風險。
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