曾安博士等首次鑒定成體存在的多能幹細胞，揭示渦蟲無限再生能力的細胞學基礎

責編丨迦 漵

圖片來源：

http://www.sciencemag.org/news/2018/06/one-newly-discovered-cell-can-remake-whole-animal

多能幹細胞（Pluripotent stem cell）是當前幹細胞研究的熱點和焦點。它可以分化成體內所有三胚層來源的細胞，進而形成身體的所有組織和器官。因此，多能幹細胞的研究不僅具有重要的理論意義，而且在器官再生、修復和疾病治療方面極具應用價值。目前多能幹細胞只能從哺乳動物早期胚胎中被鑒別並分離，或者通過重編程到多能幹細胞狀態獲得。然而迄今為止，大量的胚胎幹細胞研究還僅是在體外（in vitro）培養皿這種高度人為的環境中開展，使得在體（in vivo）研究多能幹細胞的行為，及其如何參與再生這個過程變得幾乎不可實現。

最近，美國斯托瓦斯醫學研究所（Stowers Institute）曾安博士在其博士後導師Alejandro Sánchez Alvarado教授（美國科學院院士，HHMI研究員）的指導下，首次在一種具有無限再生能力的模式生物——淡水渦蟲（planarian）中發現、鑒定、並分離了成體存在的一群多能幹細胞，這項工作發表於6月14日的Cell雜誌上【1】。

渦蟲是公認的具有最強再生能力的模式生物之一。19世紀末期，遺傳學奠基人摩爾根（Morgan TH）在從事果蠅研究之前，就主要從事渦蟲再生的研究（圖1）。他發現，渦蟲被切割至1/279份時，依然能再生出完整的個體。渦蟲無限再生的能力源自它們豐富的成體幹細胞庫。面對損傷，渦蟲幹細胞能夠增殖、分化成任何所缺失的功能性細胞，例如神經細胞、肌肉細胞等。渦蟲有超過80%的基因與人類高等同源，因此提供了一個完美的模型用於研究幹細胞介導的組織、器官再生的機制。然而直到現在，科學家還無法高效地尋找調控渦蟲幹細胞系統的基因，其中一個核心原因是維持渦蟲無限再生能力的細胞類型並不清楚。

圖1:32歲的現代遺傳學創始人摩爾根曾經的研究是每天切割渦蟲，觀察其不同區域再生能力的差別。這種好奇心驅動的，依靠科學家的洞察力及想像力的研究產生了眾多到今天依然未被解決的再生醫學中的根本性科學問題。

早在1892年，生物學家Randolph首次在顯微鏡下發現並描述渦蟲幹細胞，將其命名為Neoblasts（圖2）【2】。過去一百多年來，關於neoblasts的組成，身份和特性一直是領域內的熱點，即渦蟲體內的neoblasts是均質的還是像高等動物一樣有一定程度的分化？渦蟲體內是否存在真正的多能幹細胞等問題一直在領域內爭論不休。2011年，Whitehead研究所的Peter Reddien研究組（Sánchez Alvarado教授的前博士後）在單細胞移植實驗中，隨機移植130個幹細胞樣細胞，發現有7個細胞最終能夠分化形成所有三胚層來源的細胞，並拯救致死劑量照射的渦蟲【3】，提示至少有少量的neoblasts是具有多能性的，他們將這些細胞命名為cNeoblast（clonogenic Neoblasts）。由於文中並沒有鑒別cNeoblasts的分子標記，其是否真實存在還是由於技術原因所導致的假象；如果存在，cNeoblasts的身份到底是什麼，這些問題依然是領域內亟待解決的難題。

圖2:Randolph於1892年首次通過手繪的方式描述了渦蟲新生組織中存在少量正在分裂的細胞（圖右），並將其命名為neoblasts，這一名稱沿用至今，而具有有絲分裂能力依然是今天定義渦蟲幹細胞的重要標準。右圖上方隱約可見正在分裂的染色體。

據悉，自2006年起，曾安博士在中科院上海生科院荊清教授的指導下，歷時七年（2006-2013年），在國內獨立地建立了地中海渦蟲（Schmidtea mediterranea）單克隆品系，並首次系統地研究了渦蟲幹細胞如何通過表觀遺傳學因子HP1蛋白來響應損傷的刺激，進而參與再生【4】。在這篇JCB文章中，曾安製備了多個渦蟲特異性抗體，其中包括渦蟲幹細胞分子標記PIWI-1。2013年進入渦蟲研究領域開創者Sánchez Alvarado教授的實驗室後，通過建立渦蟲單分子基因定量技術，曾安意外地發現渦蟲的PIWI-1陽性細胞可以分為PIWI-1-high和PIWI-1-low兩個不同的細胞亞群。功能分析發現只有PIWI-1-high細胞類群包含真正的幹細胞活性。

這個結果非常的意外，與領域內當時主流的認識——Neoblasts分為三群的結果並不一致【5】。為了進一步理解是否每個PIWI-1-high細胞都有同樣的多能性特徵，曾安富集了7614個PIWI-1-high細胞，進行了單細胞RNA測序。更加意外的是，他發現渦蟲的PIWI-1-high細胞包含至少12個不同的亞細胞類群，同時找出了不同亞型細胞中特異表達的基因和蛋白圖譜。通過進一步的功能試驗，作者發現了其中一個全新的幹細胞亞群——NB2符合多能幹細胞的特性，並鑒定了其細胞表面分子標記是四次跨膜蛋白Tetraspanin-1（TSPAN-1）。

隨後作者發現，TSPAN-1陽性的NB2幹細胞是唯一可以在亞致死劑量照射渦蟲中存活並進行克隆增殖的幹細胞亞型。為了進一步證明單個NB2細胞具有全能性，作者製備了針對TSPAN-1蛋白的抗體，並建立了NB2細胞的單細胞分選技術。 通過與博士生郭龍華近兩年的合作，作者又進一步建立了TSPAN-1陽性細胞的單細胞移植實驗。通過移植224個渦蟲TSPAN-1陽性幹細胞，發現其中52個（23.2%）可以在單細胞水平上拯救致死劑量射線照射的渦蟲。揭示了TSPAN-1陽性的NB2細胞是渦蟲中決定其無限再生能力的多能成體幹細胞，而TSPAN-1蛋白正是渦蟲多能幹細胞表面的分子標記。

通過多步的單細胞表達分析技術，結合單細胞移植試驗，這個工作首次發現、鑒定並分離了一個物種成體內存在的多能幹細胞類群，這群幹細胞可以在單細胞移植實驗中重建整個渦蟲（圖3）。這個發現更新了一個多世紀以來領域內對渦蟲幹細胞組成和身份的認知，揭示了渦蟲無限再生能力的細胞學基礎。同時，TSPAN-1分子在所有的多細胞生物都高度保守，其同源蛋白被發現特異性地表達在多種組織、類型的成體幹細胞中，而該蛋白的異常表達在白血病等惡性腫瘤的腫瘤幹細胞中也被廣泛證實，此工作對理解其他幹細胞的分子和功能的異質性也有重要的理論價值和指導意義。

圖3:渦蟲身體任何一個片段切割後都能再生出一個完整的渦蟲（左圖）。單細胞測序結合單細胞移植揭示了渦蟲無限再生能力的細胞學基礎（右圖）。

在大多數生物，內源性的多能幹細胞只在早期胚胎髮育瞬間存在，隨著個體的發育，這些細胞逐漸分化成其他組織器官的細胞，並因此丟失了多能性。而自然界少數能夠再生的物種，例如渦蟲在成體也長期維持了這群多能幹細胞，使得它們具備了無限再生能力及不會衰老的特性。因此鑒別這群細胞是進一步研究這群成體多能細胞參與再生過程的行為和功能調節的基石。由於這群細胞的分子標記TSPAN-1在所有多細胞生物高度保守，這個研究也必將會對其他物種幹細胞、及再生機制的研究提供重要借鑒意義。

據悉，這個工作從構思到最終完成歷時近五年，作者克服了領域內多個實驗技術的瓶頸，是渦蟲再生這個嶄新研究領域發表在Cell雜誌上的第一篇研究型論文。與這個工作同一時期進行的另外兩篇工作，僅開展了單細胞RNA測序揭示渦蟲成體細胞圖譜，最近也發表在Science上【6，7】，進一步驗證和支持了這篇Cell文章的單細胞測序部分的結果。

由於該工作具有重要的科學意義，Cell雜誌發表了題為「Prospecting for Planarian Pluripotency」的previews，此外Science和Nature雜誌都在第一時間進行了報道，並給出了極高的評價，其中Science雜誌引述專家的評論稱該工作是」（渦蟲）領域內的重大突破「（is a major breakthrough in the field）。

曾安博士簡介：2013年博士畢業於中科院上海生科院，導師為荊清研究員。現為美國斯托瓦斯醫學研究所(Stowers Institute), 霍華德?休斯醫學研究所(HHMI), 博士後研究員。師從美國國家科學院院士、藝術與科學院院士、HHMI 研究員Alejandro Sánchez Alvarado教授。自2006年起在國內建立了第一個地中海渦蟲（Schmidtea mediterranea）研究體系用於組織、器官再生的機制研究。主要研究方向是利用渦蟲（planarian）為模式生物，研究組織、器官再生的細胞及分子學基礎。主要研究貢獻：1）首次揭示組織幹細胞參與渦蟲再生的表觀遺傳學調控機理 （2013，JCB）; 2）利用大規模單細胞基因表達分析技術，結合單細胞分選、單細胞移植等實驗手段，揭示了渦蟲無限再生能力的細胞起源 （2018，Cell）。曾獲得2013年中國科學院院長獎優秀獎，2012年美國Keystone Symposia會議Future of Science Fund獎學金等。

參考文獻：

1.Zeng, A. et al. Prospectively isolated Tetraspanin+ neoblasts are adult pluripotent stem cells underlying planaria regeneration.Cell, https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.06.006 (2018)

2.Randolph, H. (1897). Observations and experiments on regeneration in planarians.Arch

Entw Mech Org5, 352–372.

3.Wagner, D et al. (2011). Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration.Science332, 811-816.

4.Zeng, A. et al. (2013). Heterochromatin protein 1 promotes self-renewal and triggers regenerative proliferation in adult stem cells.J Cell Biol201, 409-425.

5.van Wolfswinkel, J.C. et al. (2014). Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment.Cell Stem Cell15, 326-339.

6.Fincher, CT et al. Cell type transcriptome atlas for the planarian Schmidtea mediterranea.Science, 2018 May 25;360(6391).

7.Plass, M. et al. Cell type atlas and lineage tree of a whole complex animal by single-cell transcriptomics.Science, 2018 May 25;360(6391).

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