免疫學單細胞研究新技術

人體的免疫系統是一個非常龐大，而且非常分散、各自為政(decentralized)的守衛大軍。儘管有數十億分工明確的免疫細胞不停地守護著人體的安全，但是我們很難明確指出，在某個時刻、某個地方，哪個免疫細胞在執行什麼任務。隨著蛋白質組學技術和基因組學技術的發展，科研人員也在不斷加深他們對人體免疫系統的認識和了解。研究人體免疫系統是一個非常龐大的工程，這項工作產生的數據量將會是人類基因組計劃(Human Genome Project)數據量的1000億倍。

數十年來，免疫學家主要依靠流式細胞技術(flow cytometry)開展免疫學研究，並通過不同的熒游標簽對細胞進行標記和研究。近8、9年來，該領域又興起了質譜流式細胞技術(mass cytometry，又名CyTOF)。該技術主要利用金屬離子對細胞進行標記，它為科研人員提供了更多與腫瘤、結核和瘧疾等病理狀態下的免疫反應有關的信息。

可是，這些技術也只能一窺皮毛，無法真正了解T細胞和B細胞的詳細工作情況。據美國紐約斯隆凱特琳癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center in New York City)的分子生物學家Jennifer Sims介紹，由於這些細胞都會表達獨特的蛋白質分子，比如T細胞受體和B細胞受體，所以也能精確地識別特異性的靶標，並做出相應的反應，而且這一系列生理過程還都在不斷的進化之中。免疫細胞可以說是人體內最「有個性」的細胞了。

這些細胞表面受體能夠識別各種病原體和腫瘤細胞表達的各種特異性的分子和抗原。一旦受體偵測到有害的抗原，它們就會激活免疫細胞，使其增殖，並且轉移到有害物質所在位置，發動免疫攻擊。每一個受體都是由免疫細胞內大量的基因重排之後編碼而成的，都是獨一無二的。上個月，美國芝加哥市召開了美國癌症研究學會(American Association for Cancer Research)，其中有一個分會場就是專門討論T細胞分析技術的。在我們一生中，這些與疾病鬥爭的免疫細胞可以表達出1020個不同的受體，Sims就是這個專場的主席。

科研人員希望通過對這些受體(包括B細胞受體)的研究能揭開人體免疫系統進化，以及對抗疾病之謎。可是流式細胞技術只能獲得非常粗淺的信息，比如哪些細胞增多了，哪些細胞變少了，而免疫受體分析技術(immune-receptor profiling method)則可以明確指出哪一些細胞克隆參與了免疫反應。據美國麻省理工學院(Massachusetts Institute of Technology, MIT)的化學物理學家Alex Shalek介紹，科研人員為了研究這些特化的受體，以及進一步提高單細胞分析技術，又開發出了一大批以測序為基礎的研究手段。Shalek自己的實驗室也開發了一系列的工具，來研究這些免疫細胞在正常和病理狀態下，彼此之間是如何相互作用的。Shalek設想，正如DNA僅僅依靠ATGC這四個「字母」就可以編碼出大量的基因，從理論上來說，如果利用特異性的DNA小片段對抗體進行標記，也可以標記無數抗體蛋白。

而且，這些試驗技術還可以極大地豐富免疫學的研究手段，比如科研人員就可以藉此開展轉錄組學研究工作等。雖然目前這些技術還不如流式細胞技術那麼完善和成熟，但是這些以測序技術為基礎的研究手段可以在任何一個有測序儀的實驗室開展，也可以在醫院、診所里使用。未來隨著測序儀的小型化和便攜化，還可以在更多的地方得到應用。科研人員現在至少有6種商業化的系統可以選擇，也可以設計最適合自己需要的試驗方法，來研究單個免疫細胞里的RNA和蛋白質，將隱藏在這些RNA和蛋白質里的秘密破譯成DNA測序儀可以輕而易舉解讀的「明碼文件」。

Sims認為，綜上所述，這些新技術都可以幫助科研人員用更精細的手段去認識不同免疫細胞在不同病理微環境下的活動和作用。

從熒游標記到金屬標記

流式細胞技術是一種光學研究手段，它可以將細胞按照不同的特性進行分類，比如根據細胞的大小、是否含有顆粒(granularity)、是否表達某些特殊的分子(可以用熒游標記的抗體標記這些分子)等。流式細胞技術之所以叫「流式」細胞技術，就是因為細胞會「流過」一個個激光發射器和檢測器，接受這些設備的檢驗和分析。

數十年來，流式細胞技術一直都是免疫學研究的最主要手段，但它也有自身的劣勢和局限性。比如，可見光譜的波長範圍就是一種限制，使得我們可以選擇的標記物只有十幾種而已，這麼少的標記物完全不能研究細胞群體，或者複雜的細胞表型。

2009年，加拿大多倫多大學(University of Toronto in Canada)的化學家Scott Tanner想到了一個好主意，那就是CyTOF。這是一種將流式細胞技術和質譜技術相結合的新技術，使用金屬來標記抗體，這一下子就將標記物的數量提升到了50多種。

美國斯坦福大學(Stanford University)的遺傳學家Garry Nolan等人使用CyTOF一次檢測了人骨髓細胞的34種不同的參數，同時跟蹤檢測了不同免疫細胞對不同藥物的反應。自此，CyTOF一下子就流行開來了。美國斯坦福大學的生物化學家Sean Bendall當時也參與了Nolan的工作，據他介紹，這種新技術讓他們一下子進入了真正複雜的單細胞(及少量細胞群)研究世界，他們不用再關注免疫反應是在哪裡發生的這個問題了。DVS Sciences公司是世界上第一個推出商業化CyTOF的公司，該公司於2014年被美國南加州的Fluidigm公司收購。

做流式細胞試驗的科研人員通常都會選擇少數幾種標記物來對每一種免疫細胞進行標記，比如使用CD19來標記B細胞，CD4或CD8來標記T細胞等。不過，這種方法只能解決大致的問題，因為這幾種熒光染料的激發光譜和發射光譜都有重疊，所以得到的熒光圖像都不太清晰。可是以色列理工學院(Technion Israel Institute of Technology in Haifa)的神經免疫學家Asya Rolls想從全局上了解小鼠大腦里的免疫細胞都在幹什麼，於是她決定使用CyTOF。

她同時選擇了44種不同的抗體，結果有了一個重大的發現——有一部分T細胞表面表達了大量的CD86分子。在體內的其它地方，T細胞通常都不會表達CD86分子，這種分子只會在其它免疫細胞表面表達，起到調節T細胞活化的作用，在腦內的T細胞上發現CD86分子是非常奇怪的。因此，Rolls認為CyTOF是一種非常好的研究手段。

在使用CyTOF發現了哪一些細胞、哪一些分子值得關注之後，再使用流式細胞技術就比較合適了。因為流式細胞技術的檢測速度非常快，每秒可以對1萬多個細胞進行檢測，而CyTOF的速度只有每秒1千個細胞。而且CyTOF每一個樣品都會使用很多種不同的抗體，因此，失敗的代價也很大。而且經CyTOF檢測過的細胞也不能再使用了，因為和質譜檢測一樣，這些樣品需要經過氣化才能進行檢測。

但是CyTOF可以對每一個細胞、每一個化合物進行多參數檢測，這就可以開展表觀遺傳學組(epigenome)研究。美國斯坦福大學的一個課題組就開展了這樣的研究。他們在上個月報道，年長者體內免疫細胞的表觀遺傳學異質性(epigenetic heterogeneity)更高。這一現象也印證了我們長期以來的一個假設，即人體的免疫系統會隨著年齡的增長而衰老，細胞之間在基因表達方面的差異會越來越大。

成熟B細胞等適應性免疫細胞可以表達多種不同的抗原受體。

DNA標記技術

差不多十年前，開始出現了一大批使用CyTOF的論文，這也引起了美國加州大學舊金山分校(University of California, San Francisco)的物理學家、微流體設備(microfluidics device)的開發者Adam Abate的興趣。據Abate介紹，他當時也在看Garry Nolan的論文，兩者也在定期座談、交流。這些研究也讓Abate意識到同時研究單個細胞的多個參數的重要性。CyTOF的出現也催生出了一大批蛋白質標記物的出現，從過去的十幾個一下子增長到了100個左右。但是Abate認為還可以更多一點標記物。人體細胞內大約有2萬多個蛋白質編碼基因，還有1萬多個變異體。所以我們肯定還需要更多的標記物。

於是Abate開始嘗試使用另外一種完全不同的標記方法，那就是DNA小片段標記方法。僅僅依靠ATGC這四個鹼基就可以編碼出無數個獨特的條形碼序列(barcode)，用來標記各種細胞和分子。Abate利用這些經過了DNA序列標記的抗體對細胞進行染色，然後將細胞送入儀器，裂解細胞，並且將抗體上的標記序列裂解成二級序列(second barcode)，然後根據這些序列判斷出相應的細胞，最後用DNA測序儀對這些序列進行分析。為了能夠對單細胞進行分析，Abate也用上了微流體設備。他們開發出了Abseq技術，將一個個經過抗體染色的細胞注入只有10微米大小的液滴中，這些液滴里含有特定的DNA條形碼，可以對細胞和抗體進行標記。儘管與流式細胞技術相比，Abseq技術的處理速度更慢，但是從理論上來說，Abseq技術可以對單個細胞里的無數個蛋白質進行檢測和分析。這樣一來，我們就可以了解在不同的病理狀態下，都有哪些免疫反應在發生。這對於腫瘤這種高度異質性的疾病尤為重要，因為每一種腫瘤激活或抑制的免疫細胞都有可能不一樣。

Abate實驗室的博士後Sam Kim參與了Abseq技術的開發過程，他認為，只有和其它單細胞技術結合起來，才能發揮出Abseq技術的真正實力。因為Abseq技術的輸出結果都是測序儀可以直接讀取的，所以完全可以和其它單細胞突變信息、蛋白質組學、轉錄組學等各個組學數據結合起來，以發揮出更大的作用。

美國南三藩市(South San Francisco)的Mission Bio生物科技公司已經註冊了Abseq技術，準備開發這種多組學研究系統。去年10月在美國佛羅里達州召開了美國人類遺傳學學會(American Society of Human Genetics)年會，Mission Bio生物科技公司在此次大會上首次推出了他們的基因突變分析系統，他們現在也已經開發出了蛋白質和RNA分析系統。美國加利福尼亞州的BD生物科技公司也在開發類似的技術。去年9月，BD生物科技公司也推出了他們的定製化單細胞分析產品——Rhapsody系統。據該公司負責Rhapsody系統的產品經理Nikhil Rao介紹，他們這套系統不是做全轉錄組分析的，而是根據客戶的要求，重點研究幾百個轉錄體，這就將數據量縮減了一個數量級，也節省了大量的成本。BD生物科技公司計劃在今年晚些時候，將他們自己的AbSeq產品也納入Rhapsody系統之中，使其同時具備蛋白質分析能力。

DIY你的專屬研究平台

據Shalek介紹，單細胞轉錄組學分析技術還可以用於對整個免疫系統進行研究。這些新技術也給我們提供了一個前所未有的新窗口，從全基因組的角度來觀察細胞在某個時刻的基因表達情況。

現在，研究人員既可以購買商業化的設備，也可以自己DIY研究平台。2015年，美國哈佛醫學院的兩個課題組就分別開發出了inDrop平台和Drop-seq平台。這兩個平台都使用了微流體設備，在全基因組層面對細胞的RNA表達情況進行了分析，可以一次對數千個細胞進行檢測。今年2月發表的一篇論文介紹了如何利用3D列印技術打造出一個緊湊版的Drop-seq平台。

在商業化方面，美國加利福尼亞州的10X基因組學公司則推出了一款高端設備，他們可以在一天內，將細胞樣品轉換成測序數據。英國的Blacktrace Holdings公司則推出了兩款設備，一種是整體式設備，提供了全套服務;另外一種則是模塊化設備，可以根據自己的需要進行個性化的組裝。

不過這些液滴式的技術也有其弊端。比如無法應用於只含有少量細胞的臨床樣品、如果在每個液滴里只含有一個細胞，就會浪費大量的試劑等。

Shalek和美國麻省理工學院的化學工程師Christopher Love為了解決這些問題，開發出了Seq-Well這種單細胞RNA測序系統。Seq-Well系統可以讓細胞懸浮在一個含有8.6萬個大小不到毫微升(subnanolitre)的小孔的硅晶元上。Shalek指出，你可以把這個硅晶元想像成家裡製作冰塊的冰盒。BD公司也使用了類似技術，通過這些小孔來固定這些細胞。

Shalek認為，Seq-Well系統最突出的一個優勢是便攜性。他們實驗室的工作人員就帶著這套系統去過泰國，幫助那裡的同事分析間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)感染者的細胞。他們也為南非德班的非洲健康研究所(Africa Health Research Institute in Durban, South Africa)的科研團隊進行過Seq-Well系統的培訓，讓那裡的科研人員使用Seq-Well系統對采自非洲HIV病毒感染者的淋巴結樣品進行免疫細胞分析。

關於採集多組學數據的研究策略，也在不斷發展中。比如去年，就有兩個課題組分別使用REAP-seq平台和CITE-seq平台同時對單細胞進行了蛋白質和mRNA分析。美國紐約大學Langone醫學中心(New York University Langone Medical Center)和德國波恩的多機構合作組織——西德基因組中心(West German Genome Center)也正在聯合開發類似的技術。Langone醫學中心方面的負責人Pratip Chattopadhyay表示，客戶可以將他們的試驗樣品寄給他們，由他們來做單細胞分析。西德基因組中心則主要負責組織專家組提供技術諮詢。

德國波恩的德國神經變性疾病中心(German Center for Neurodegenerative Diseases in Bonn)的腫瘤免疫學家Joachim Schultze表示，這是一個發展得非常快的領域，湧現出了大量的新技術、新方法。沒人能夠預測在十年之內，這個研究領域會發展到什麼地步。

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