看點：研究染色質轉錄複合體更高效的ChIP-SICAP方法。

關鍵詞：

ChIP-SICAP：ChIP with selective isolation of chromatin-associated proteins，選擇性分離染色質相關蛋白的 染色質免疫共沉澱檢測技術。

ChIP-MS：染色質免疫共沉澱技術後續使用 質譜技術檢測鑒定蛋白。

RIME：rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins，快速沉澱染內源性蛋白的免疫共沉澱技術。

Nanog：iPS因子之一，幹細胞生物學的重要轉錄因子。

結論：ChIP-SICAP方法能有效的分析iPS因子Nanog轉錄複合物。

結果展示如下：

針對Nanog轉錄因子的 ChIP-SICAP ChIP-MS 和 RIME 三種方法效率的鑒定:

A：ChIP-SICAP ChIP-MS 和 RIME 三種免疫沉澱方法和全蛋白質組質譜分析後，蛋白丰度和互作度的比較。

縱坐標 Log(Intensity)：蛋白互作度指標，數值小表明其互作蛋白數目少。

橫坐標 Protein Ranks：蛋白富集丰度的排序，數值小的丰度高。

黃色點 Histones：組蛋白，修飾/未修飾的集合。

紅色點 Nanog interactors：通過BioGRID資料庫預測出和Nanog互作的蛋白

灰色三角 Ribonucleioproteins：核糖核酸蛋白

黑色三角 Ribosomal Protein：核糖體相關蛋白

注意Ａ左圖：ChIP-SICAP 富集和檢測方法能有效分析iPS三因子的聯合轉錄情況。

B：ChIP-SICAP ChIP-MS 和 RIME 三種免疫沉澱方法和全蛋白質組質譜分析後，蛋白丰度的分類。

亮綠色：Nanog interactors：Nanog的互作蛋白。

暗綠色：chromatin/DNA binding proteins：其他類轉錄因子和染色質相關蛋白。

琥珀色：ribosomal proteins ：核糖體蛋白。

橙色：ribonucleoproteins：核糖核酸蛋白。

橙紅色：細胞質蛋白。

#測量值為質譜富集蛋白碎片丰度與總蛋白的比值。

PTP, potential true positive：真陽性率。

PFP, potential false positive：假陽性率。

注意Ｂ最右一欄：ChIP-SICAP 富集和檢測方法對Nanog的真實互作物的發掘比較有效。

C：ProteinA 與陰性對照IgG對富集蛋白數量的比較。

IP實驗通用的ProteinA IgG在ChIP-SICAP 實驗中具有較低的假陽性率和污染率。

Ｄ：四類蛋白丰度的累積密度曲線比較：

注意藍線：Nanog的互作物主要在細胞核的轉錄調控類別，而非細胞質的翻譯類別。

材料來源：Molecular Cell2016

Expanding the Circuitry of Pluripotency by Selective Isolation of Chromatin-Associated Proteins

Fig2.Comparing Performance of ChIP-SICAP to ChIP-MS and RIME Using Nanog as the Bait

ChIP-SICAP方法簡介：

前處理和ChIP基本一致：多聚甲醛交聯後用超聲波打碎。

使用合適的抗體進行免疫沉澱。

使用生物素標記的TdT標記DNA探針和ddUTP

使用SDS對抗體進行復性，解交聯蛋白。

使用鏈霉親和素磁珠富集染色質互作蛋白。

進行高嚴謹性洗脫，洗去過量的遊離蛋白。

升溫的方法解交聯獲得染色質片段。

通過質譜方法分析互作蛋白。

#通過DNA末端標記酶標記生物素ddUTP到ChIP捕獲複合體DNA末端，便於鏈霉親和素磁珠親和吸附。

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