高通量磷酸化蛋白質組學深入解讀大腦內GPCR信號轉導通路

今天跟大家分享一篇最新發表在science上的文章『In vivo brain GPCR signaling elucidated by phosphoproteomics』，通訊作者是來自德國馬克斯普朗克生物化學研究所的Matthias Mann教授。Matthias Mann教授是蛋白質組學研究領域的領軍人物，其課題組一直致力於質譜技術的開發和在生物學研究領域的應用，例如我們熟知的組學定量方法SILAC以及MaxQuant系列演算法等都是由其建立，並且通過與生物學家的廣泛合作，該課題組利用先進的質譜技術先後在人類蛋白質組水平揭示了大量存在的磷酸化位點譜圖、賴氨酸乙醯化位點譜圖以及糖基化位點譜圖等。

該篇science的工作也是該課題組發展的一種「高通量磷酸化蛋白質組學（EasyPhos）」技術的拓展應用。EasyPhos技術是Mann實驗室於2015年開發的用於快速高通量定量磷酸化位點並實現深度覆蓋的技術，例如可同時在96孔板中對不同種類的細胞或組織的磷酸化蛋白質組進行分析並鑒定到>10000個磷酸化位點。傳統的磷酸化蛋白質組學工作流程包括使用FASP（過濾輔助樣品製備）或基於尿素的蛋白質酶解、肽段脫鹽和懸干、肽分餾（fractionation）、IMAC或TiO 2富集磷酸肽以及LC-MS/MS技術鑒定，而EasyPhos技術優化了蛋白質酶解buffer，使其與磷酸肽段的富集兼容，從而省去了肽段脫鹽和肽分餾的步驟，同時使該樣品製備能在96孔板中進行，實現了高通量操作。

而該篇science工作利用EasyPhos技術，以阿片受體（一種G蛋白偶聯受體）為模型，通過對小鼠大腦不同區域內50000個磷酸化位點的量化，深度解讀了大腦內阿片受體被激動劑激活之後的信號通路變化。

G蛋白偶聯受體（GPCR）超家族是神經疾病的主要藥物靶標，但即使刺激單一的GPCR通常也會激活許多平行的信號通路，每個通路都會導致獨特的藥理結果，因此基於GPCR設計的激動劑藥物都會或多或少的有些副作用。以kappa阿片受體（kappa opioid receptor，KOR）為例，KOR在中樞神經系統中廣泛存在，且在不同的大腦區域表達量不同，激活後的生理效果也不一樣。現有的研究已經表明KOR激動劑藥物激活KOR後，會引起膜電位超級化，使神經遞質釋放減少，阻斷神經衝動的傳遞，因而該類藥物具有很好的鎮痛、抗驚厥等療效。但不幸的是，該類藥物會誘發焦慮、厭惡等副作用，對於副作用的機制至今沒有很好的解釋以及相應的治療策略。該研究中，作者利用高通量磷酸化蛋白質組學對KOR激動劑誘導的信號通路進行了深度解析並找到了其誘導厭惡副作用的靶點。

首先作者用五種不同結構的KOR激動劑注射小鼠，於注射後5分鐘和30分鐘後，分別獲取了大腦五個區域的組織（紋狀體、海馬、皮質、延髓和小腦，前四種組織不同程度表達KOR，最後一種組織不表達KOR），接著利用EasyPhos技術對五種組織的磷酸化蛋白質組進行了鑒定，實現了對6700個腦蛋白的50000個磷酸化位點的定量，並觀察到不同的KOR激動劑對這些磷酸化位點的擾動程度是不一樣的，且具有區域特異性和時間動態性。其中激動劑 U-50,488H對這些磷酸化位點擾動最大，且主要集中在紋狀體區域，例如注射U-50,488H激動劑5分鐘後，紋狀體即有1000個磷酸化位點發生變化，對這些磷酸化位點發生變化的蛋白進行GO生物功能分析發現主要在 「神經遞質分泌」 和 「多巴胺能神經突觸」 功能中有富集。鑒於副作用厭惡狀態的出現是由於紋狀體區域伏核（nucleus accumbens，NAc）內的棘突神經元被激活，因此作者接下來著重關注給予KOR激動劑處理後紋狀體區域內突觸蛋白磷酸化水平差異。作者通過對U-50,488H刺激5分鐘後紋狀體突觸蛋白磷酸化水平的差異分析發現，突觸蛋白被大規模去磷酸化，於是作者猜測U-50,488H可能特異性激活了Ser/Thr 磷酸酶系統。為了驗證這一假設，作者給小鼠注射了磷酸酶抑製劑，發現U-50,488H誘導的突觸蛋白的廣泛去磷酸化現象消失，證明了磷酸酶在突觸GPCR信號轉導中的重要性。更重要的是，作者通過對U-50,488H誘導的信號通路的變化分析發現，mTOR信號通路是排在首位的，被U-50,488H顯著激活，而以往的研究也表明紋狀體內mTOR信號通路功能障礙跟重度抑鬱有關係。於是作者進一步猜測KOR激動劑U-50,488H誘導的厭惡副作用跟mTOR通路有關。為了驗證這一猜測，作者先給予小鼠mTOR信號通路抑製劑處理1h後再給予U-50,488H處理，小鼠動物模型的厭惡副作用消失，而其鎮痛、抗驚厥的療效不受影響。

該研究首次利用高通量磷酸化蛋白質組學深入解讀大腦內GPCR信號轉導通路，為治療GPCR激動劑藥物誘發的副作用以及未來開發更有效的GPCR藥物提供研究策略。

本文作者：ZST

文章引用：

DOI: 10.1126/science.aao4927

文章鏈接：

http://science.sciencemag.org/content/360/6395/eaao4927.full

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