基因修飾小鼠模型在腫瘤學研究中的應用

作為腫瘤學研究的工具，GEM模型更能模擬人腫瘤的組織病理學和分子學特徵，表現為有更好的遺傳異質性，其優勢在於能反映腫瘤細胞自身，以及腫瘤微環境中細胞等相互作用因素，包括具有引起原發腫瘤開始形成到發展為轉移性疾病的能力。GEM模型的建立及應用極大促進了腫瘤學研究領域發展與進步。

前言

相對於過去常用的腫瘤細胞接種和免疫缺陷小鼠模型，基因修飾小鼠（GEM）模型是建立在天然完整免疫條件下的原發（de novo)腫瘤，因此，作為腫瘤學研究的工具，GEM模型更能模擬人腫瘤的組織病理學和分子學特徵，表現為有更好的遺傳異質性，其優勢在於能反映腫瘤細胞自身，以及腫瘤微環境中細胞等相互作用因素，包括具有引起原發腫瘤開始形成到發展為轉移性疾病的能力。GEM模型的建立及應用極大促進了腫瘤學研究領域發展與進步。目前，GEM模型已成功應用於驗證潛在腫瘤基因與藥物靶點，考核治療效果，分析腫瘤微環境影響，以及評價藥物耐藥性機制等研究領域。而且，結合臨床病人研究與構建更加合理有效的GEM模型，優化腫瘤干預的臨床前試驗，無疑將進一步促進腫瘤治療新策略的研發，提高其有效轉化為臨床上實際應用的成功率。

目前腫瘤學研究面臨的主要挑戰

腫瘤學研究及腫瘤治療在臨床上仍然面臨著許多挑戰，其中抗腫瘤藥物耐受性的形成和腫瘤轉移性疾病是當前面臨的兩個重要現實難題。抗腫瘤耐藥性的產生是由於異質性腫瘤中的原發突變的出現，或治療前耐葯克隆的大量生長引起的，而現有靶向抗腫瘤製劑的單一療法，或化學藥物療法都無法避免藥物耐受的發生。而且，在獲得明顯成功治療之後，少量藥物耐受腫瘤細胞可以存活下來，並在一定時間後，成為主要細胞群，最終形成與原始腫瘤表型不同複發疾病。而腫瘤轉移性疾病則是導致超過90%以上與癌症相關死亡的原因，因為現在對於這些繼發腫瘤也多無有效的治療方法。近年來，雖然針對干預腫瘤病人免疫系統的腫瘤免疫療法取得了一些令人鼓舞的進展，但該療法也只是對一些特定病例情況下有效果，而對於大多數腫瘤病人仍不具有實際臨床意義。

所謂成功的腫瘤治療往往需要多種方法的協同作用，比如手術，發射線照射，細胞毒性療法，以及免疫療法等綜合策略。為了設計出有效合理的綜合治療措施與方案，首要的基礎與前提是深入了解腫瘤的形成與發展，轉移，及治療應答過程中，腫瘤細胞自身及其微環境細胞間相互作用的機制，從而尋找針對不同的腫瘤類型最有效的治療方法。為了實現這一目的，研究者們就必須依賴於動物模型的臨床前研究。過去儘管依賴於傳統臨床前小鼠模型，即通過建立移植人腫瘤細胞系或同種小鼠腫瘤細胞系模型等方法，獲得了臨床前抗癌新療法的成功驗證，但絕大多數的這些新療法在臨床III期試驗中卻都最終以失敗而告終。

總體上講，由於傳統體內腫瘤小鼠模型在預測臨床新療法效果方面的表現不佳，因而更加凸顯尋找具有更好預測能力及效果的改進型臨床前體內模型的意義與價值。最近在基因修飾技術方面的進步與發展，使得快速研製能更有效模擬人腫瘤的GEM模型成為現實，GEM模型在遺傳組成，腫瘤細胞與其腫瘤微環境的相互作用，藥物反應及耐受等方面都更接近腫瘤病人。而新一代GEM模型的出現，也大大促進抗腫瘤新療法策略轉化為臨床應用，最終達到有助於提高癌症病人生存率的目的。

腫瘤學研究中常用傳統小鼠模型的優勢與不足

50年前首先在裸鼠體內移植人/鼠腫瘤細胞系而建立的小鼠腫瘤移植模型成為腫瘤研究中常用的小鼠模型，這類移植模型可快速測試潛在腫瘤及轉移相關基因，並成為臨床前的藥物試驗主要工具。例如，通過異種移植研究有助於揭示結腸癌（CRC）對藥物（如Vemurafenib)在小鼠體內的耐受機制，從而實現在臨床試驗中對CRC病人啟動了同時針對突變BRAF（如V600E）和EGFR的靶向聯合療法，表明這類異種移植模型在建立新的聯合治療策略方面的實際意義。

異種移植研究也有助於發現特定基因表達特徵，研究其介導的器官特異性定位轉移的特點。如應用該種模型證實了傳播的乳腺癌細胞存在於血管附近，這為調控這些傳播的乳腺癌細胞提供了可能的對策。而且，應用這類細胞系移植的體內模型研究，也為抗腫瘤免疫，T細胞耐受機制，腫瘤免疫逃逸途徑等提供了許多基本的認識概念。這些發現都為目前進行中的腫瘤免疫療法的突破奠定了基礎。

然而，由於腫瘤細胞系一開始就含有許多突變，而且在體外長時間培養過程中，還會產生額外突變，因此，此類接種模型難以真實反映人腫瘤細胞的形態學和遺傳異質性，從而降低了該類模型作為臨床應用效果預測性的可靠性。另外，為了防止可能的排斥反應，腫瘤細胞系的異種移植模型是建立在免疫缺陷小鼠基礎上，這也限制了其應用於腫瘤發展中免疫系統以及治療應答等領域的研究。

不同於細胞系移植模型，通過將新鮮人腫瘤活檢物移植至免疫缺陷小鼠構建的病人來源的腫瘤移植（Patient-derived tumor xenografts，PDTX，或PDX）模型則具有更多優勢，PDX小鼠模型的腫瘤保留了來自腫瘤病人在分子，遺傳，組織學異質性等特徵（甚至經過小鼠體內的傳代幾代之後）。所以，PDX模型也成為目前個性化醫學和臨床前藥物篩選的有用工具。

目前，PDX的大規模研究已應用於潛在臨床藥物預測試驗。有研究者通過構建約1000個來自多元化不同類型突變的PDX模型，並應用這些不同的PDX模型對不同藥物進行小鼠體內篩選，尋找藥物與腫瘤基因型之間的關聯性，以達到試驗重複性和臨床可解釋性的統一。最近有應用三陰乳腺癌建立的PDX模型，結合單細胞基因表達分析證明，早期細胞表達特徵標記主要為幹細胞樣基因，發現了具有阻斷乳腺癌轉移的潛在藥物新靶點。

不幸的是，PDX模型在研究某些腫瘤類型方面（如雌激素受體陽性的乳腺癌和前列腺癌）的不滿意效果成為了限制其應用的主要障礙。而且，PDX模型必須建立在免疫缺陷小鼠上，這樣的小鼠缺乏由獲得性免疫系統介導的天然抗腫瘤與促腫瘤活動。

研究者們也明白，雖然PDX模型缺乏功能性的獲得性免疫系統，該模型仍可為臨床提供有價值的研究資料。正在進行中的相應改進努力是通過移植人CD34陽性造血幹細胞或前體細胞的方法，實現重建人免疫系統的人源化的小鼠模型，也取得了顯著的成功。雖然來自某些特異譜系的人免疫細胞在小鼠體內的重建仍具有挑戰性，但通過引入人相關細胞因子，趨化因子，生長因子等方式，獲得增加人骨髓細胞在小鼠體內發育與成熟的效果。

為了構建優化的能夠支持人HLA限制性T細胞發育的免疫缺陷小鼠，應用基因修飾技術建立將人HLA分子引入至敲除小鼠MHC類型I和II相應區域的人源化小鼠模型。人源化小鼠模型能作為免疫療法臨床前評價的有用平台，然而，當人造血幹細胞供體來源（如通過臍帶血或胎肝）有限時，其現實操作中的較高構建成本也自然成為該模型實際應用的不利因素了。

應用不斷完善GEM模型研究原發腫瘤

上世紀70年代成功建立小鼠原核注射轉基因技術以後，藉助該方法於1980年代早期第一次將克隆癌基因導入小鼠基因組中，成功製備了所謂的致癌小鼠（Oncomice)。 該致癌小鼠是應用乳腺特異性起動子（MMTV）特異性表達癌基因v-HRas的第一個腫瘤GEM模型，該致癌小鼠的首次構建成功，並證實了該小鼠形成原髮乳腺腫瘤。極大地振奮了腫瘤研究領域團體，因為此研究結果是第一次真正證明了癌基因在正常細胞中表達能產生腫瘤的假說。1992年伴隨著小鼠胚胎幹細胞（ES）基因打靶技術的突破發展，成功構建腫瘤抑制基因（TSG）敲除小鼠，也證明了該類TSG基因在腫瘤發生過程中的重要作用。

雖然致癌小鼠和 TSG 敲除小鼠提供了非常有價值的理論依據，但這兩種模型也存在其局限性。由於轉基因技術是種特定組織中所有細胞表達外源基因，TSG敲除小鼠是滅活體內所有細胞中的相關基因。然而，現實腫瘤形成過程是在個體中整個組織器官健康的前提下，由於某個單細胞中某種遺傳變異的積累而導致的分散腫瘤現象。為了符合腫瘤形成過程的實際情況，更有必要設計與構建更加合理或複雜小鼠模型，比如能實現條件性的在體細胞滅活腫瘤抑制基因，或者激活（突變）致癌基因的所謂條件性GEM模型。條件性GEM模型構建的基本原理是將需要修飾基因兩端分別加上loxP重組位點，在特定Cre重組酶存在的情況下，loxP兩端之間的DNA就可被敲除，達到特定條件下滅活該基因的目的。應用這種模型的第一個成功例子是應用Cre-loxP系統介導的體細胞滅活Apc基因而構建的小鼠結直癌模型。應用腺病毒載體實現Cre重組酶特異性表達於腸上皮細胞，組織特異性敲除APC基因，引起小鼠快速形成散在結直腺瘤，其特徵與家族性結腸腺瘤性息肉病（FAP）病人有許多相似性。所以，通過發現特異性相關癌症基因的突變體，研究者們可構建能更能模擬腫瘤病人在組織學上，分子學上，以及臨床上相似特徵的小鼠模型。

藉助Cre-ERT融合蛋白誘導系統，研究者們可實現對體細胞中相關靶基因在特定時間與特定組織實施修飾，即將雌激素受體的突變激素結合區域與Cre重組酶融合在一起，建立可誘導調控的Cre重組酶表達系統，當在雌激素類似物如Tamoxifen存在的情況下，引起Cre重組酶活性在翻譯後激活，使其發揮識別loxP位點作用，實現誘導性切割靶基因的目的。因此，LoxP小鼠（即靶基因DNA兩端分別含loxP位點）的條件性基因修飾，通過在選擇的時間裡加入誘導劑Tamoxifen後，控制Cre-ERT的特異性表達，達到對靶基因進行時空與區域上特定修飾。

雖然Cre-loxP系統能用於多於一個基因的修飾，但因這種過程是同時發生的，因而難以完全模擬腫瘤多步驟形成過程中，突變是逐漸積累形成過程的特徵。最近，研究者們利用可獨立發揮作用的可誘導雙重組酶系統（如Flp-FRT/Cre-loxP，或Cre-loxP/Dre-rox），建立了對靶基因表達實施先後調控的修飾方式。該技術方法成功應用的實際意義有如下幾方面，1. 獨立研究針對腫瘤細胞的自主和非主發通路與過程；2. 實現模擬人多步驟的癌症形成過程，有續地進行誘導突變；3. 開展獨特腫瘤治療靶點遺傳性評價。

腫瘤GEM模型構建策略與技術方面的改進

GEM模型因其獨特優勢已經被證實是腫瘤學研究的有效工具，但研究者們也一直努力對其進行著不斷改進與完善。由於該類小鼠模型在構建與研製過程中周期長，工作量大，以及成本高等原因，特別是對於多個等位遺傳位點進行修飾，構建具有遺傳特性的新突變小鼠模型時候，研製過程則更耗時，且需要更長久的交配繁殖過程。這也成為限制具有遺傳能力GEM模型廣泛實際應用中的一個主要因素。近年來，由於腫瘤基因組序列研究技術的廣泛普與應用，伴隨著新發現的癌症相關基因突變數量的快速增長，更加需要建立快速新穎的小鼠模型研製策略，實現在體內快速驗證潛在致癌基因，以及已知病人相關突變的非遺傳修飾GEM模型的目的。目前這方面的進展主要有：ES細胞為基礎的腫瘤模型；應用CRISPR/Cas9技術基因組編程；腫瘤病人相關位點的改善腫瘤模型。

1. ES細胞為基礎的腫瘤模型

為了進一步加快新型人腫瘤GEM模型研製，利用將小鼠胚胎幹細胞（ESC）經過基因修飾後而作為非遺傳修飾（如嵌合體）小鼠直接進行腫瘤學研究已成為一種研究策略。最近報道的GEM-ESC策略，即建立以ES細胞為基礎的腫瘤GEM模型。該類模型是在原有基因修飾的基礎上，快速構建新型基因遺傳修飾小鼠模型。例如，應用GEM-ESC策略，在原有K14cre-Brca1-Trp53(KBIP)的小鼠乳腺腫瘤模型的ESC上，直接導入MET原癌基因，構建新型KBIP-MET的轉化乳腺癌模型。研究結果表明，與KBIP小鼠相比，此KBIP-MET小鼠形成的乳腺癌更具有轉化特徵，表現為更容易形成癌肉瘤。在對腫瘤藥物的反應性上，KBIP小鼠模型的乳腺癌對臨床RARP抑製劑（如Olaparib)敏感，而KBIP-MET小鼠模型的轉化乳腺腫瘤則顯示對該抑製劑具有耐受性。

2. 應用CRISPR/Cas9技術的基因組編程

過去十年，伴隨新的基因組編程技術（如ZFNs和TALENs）快速發展，到2013年出現的CRISPR/Cas9基因組編程系統，該類基因組編輯技術成為繼PCR技術發展以來，過去幾年生物學研究領域的革命性進步及影響力最大的技術更新。CRISPR/Cas9系統首先發現於原核生物中針對抵抗外來入侵遺傳物質而建立的免疫系統，並很快被成功用於各類物種的基因編輯。藉助單一的引導RNA（sgRNAs), Cas9核酸酶成為能特異性作用於基因組如何基因位點，達到基因敲除的目的。通過應用Cas9誘導的DNA斷裂和單鏈核苷酸/供體DNA，該系統也可實現對特定基因突變，或特定插入loxP/FRT重組位點等遺傳修飾。

CRISPR/Cas9技術系統所表現出同時對基因組不同位點進行有效編輯等基因打靶策略特徵，立刻成為快速研製腫瘤小鼠模型的最佳選擇。目前在人腫瘤病人觀察的所以遺傳突變都可以通過基因修飾的方法而快速地構建相應小鼠模型，包括條件性基因敲除，點突變，易位等。另外，也有研究者應用CRISPR/Cas9技術對小鼠的致癌基因和TSGs進行了體細胞（非遺傳性）編輯，因此研究策略的努力與成功，使該系統成為研製肝細胞腫瘤，肺癌，腦癌，胰腺癌，以及乳腺癌的非遺傳修飾模型的新方法。

最近，CRISPR/Cas9系統也應用於靶基因的抑制（CRISPRi）或激活（CRISPRa)的遺傳修飾。這類修飾系統可用於研製相應致癌基因，和/或抑制TSGs基因的誘導和可逆激活小鼠模型。比如藉助CRISPRa為基礎的系統，通過激活致癌基因的轉錄，達到研究其致癌潛力的目的。

雖然CRISPR/Cas9為基礎的基因編輯系統非常具有潛力，但該系統應用於體內基因編輯也存在一定的缺陷，比如，目前該系統策略不適合於驗證潛在致癌基因的致癌潛力。另外，將Cas9導入體細胞的基因編輯方式，可引起Cas9特異性免疫反應，導致Cas9表達細胞被清除的可能性。為了避免這些可能潛在風險，可選擇在免疫缺陷小鼠體內進行相應的實驗，或在通過基因修飾方法，首先獲得對Cas9具有免疫學耐受小鼠模型後，再開展相應的動物實驗。最後，雖然已有報道表明，應用引起DNA單鏈斷開的可誘導Cas9n缺口酶，可以降低其脫靶效應， 但研究者在實際應用中必須有清晰認識，要想完全避免由CRISPR/Cas9介導的非設計所需要的脫靶突變是很難的。

3. 腫瘤病人相關位點的改善腫瘤模型

構建理想的腫瘤病人相關突變模型，對研究靶基因在腫瘤發生過程中的作用，以及有效評價藥物效應就顯得更加具有必要性與實際意義。因為在人腫瘤抑制基因（TSGs）中，許多具有腫瘤發生趨勢的生殖細胞突變和體細胞突變都是錯義或無義突變，從而導致突變產物或可能帶有功能截短蛋白的形成。這類突變現象是難以通過條件性敲除小鼠模型來實現的，因為條件性基因修飾策略是將靶基因中某個或幾個外顯子完全敲除，達到滅活靶基因功能。一些研究結果已經表明，參照腫瘤病人相關TSG突變構建的小鼠突變模型，可引起與靶基因完全敲除不同表型。比如，與Trp53基因敲除小鼠比較，病人相關的Trp53熱點突變小鼠表現有更加明顯的致癌活性。

同樣，構建BRCA1乳腺癌病人相關的Brca1基因突變的條件性小鼠模型研究表明，與Brac1完全敲除小鼠模型相比，引起Brac1基因中特定RING區域突變導致的乳腺腫瘤，研究也證實，由於突變導致Brac1蛋白含有較少的RING活性 表現為更容易對那些破壞DNA的藥物產生耐受性，該結果有助於揭示了這些突變與治療反應效果之間的因果關係。

GEM模型在腫瘤學研究中的應用範圍

作為原發腫瘤發生的GEM模型，可成為體內分析包括腫瘤形成，發展及轉移中腫瘤形成等過程中細胞本身與細胞間相互作用的系統選擇。人腫瘤GEM模型也已成功應用於驗證候選藥物靶點，評估治療效果，以及評價藥物耐受機制等方面。由於GEM模型是在完整免疫系統小鼠體內形成的原發腫瘤，因此，該類模型更適合潛在腫瘤免疫治療的探索性研究。小鼠與人緊密相關性研究為探索與開發腫瘤治療新方法與策略，提供了有意義的應用平台。也為設計和開發新抗腫瘤治療，提供了臨床治療效果等相關信息。GEM模型在以下幾個方面對腫瘤生物學及轉化腫瘤學等研究進展及貢獻中發揮了重要作用。

1. 驗證潛在癌基因

在大量腫瘤樣品測序研究獲得不斷增加的潛在腫瘤基因基礎上，建立體內快速驗證這些潛在腫瘤相關基因的策略是非常必要和有實際意義的。考慮到速度和相對簡單化因素，GEM-ESC和CRISPR/Cas9技術可作為快速驗證潛在腫瘤基因的首選方法。特別是應用基於體細胞的CRIPPR/Cas9介導基因編輯技術，建立非遺傳修飾的小鼠模型，實現高通量體內驗證潛在腫瘤基因的目的。比如，應用DNA注射與活體電穿孔法相結合的轉染方法，將針對引起胰腺管腺癌（PDAC）的13個不同主要腫瘤抑制相關基因的15個gRNAs/Cas9表達質粒混合物一起導入成熟小鼠的胰腺，構建同時修飾此13個基因的小鼠模型。結果顯示，此PDAC小鼠有超過60%的這些靶基因顯示基因敲除，提示CRISPR/Cas9介導的突變誘發了腫瘤的形成。同樣，利用Dox誘導Cas9表達的GEM模型也被用於驗證已知多種腸道腫瘤基因（如Apc和Trp53）。除了修飾TSGs, CRISPR/Cas9技術還應用於驗證染色體重排的致癌性，如在肺癌病人觀察到的Eml4-Alk基因的融合現象。

另外，應用GEM模型對來自臨床病人篩選獲得的候選潛在癌基因進行驗證，也已成為研究腫瘤相關基因功能的常用策略。例如，最近胡卓偉教授課題組通過構建條件性過表達和敲除GEM模型，研究假激酶Trib3基因在促進急性早幼粒細胞白血病（APL）形成中的作用，結果表明，同時在小鼠骨髓細胞中特異性表達或敲除Trib3與 致癌蛋白PML-RARa (PR) 融合基因，Trib3基因可顯著增加PR誘發APL形成的作用。而呂毅教授課題組則是通過構建Y染色體性別決定區（Sry) 基因特異性表達的GEM模型，首次證實了在肝組織內特異性過表達Sry基雄/雌小鼠對化學致癌劑（DEN）誘導小鼠肝細胞癌（HCC）形成更加敏感，提示Sry基因在HCC形成過程中發揮了重要促進作用。

2. 研究致癌基因的依賴性

致癌基因依賴現象是指某些腫瘤形成完全依賴於單一致癌基因。由於條件性GEM模型對基因的修飾是不可逆的，因而不適合研究致癌基因依賴性。因此需要選擇不同的調控誘導策略進行相應的研究，例如將致癌基因與ERT融合達到控制其表達的目的。有研究報道，將Trp53-ERT變異體取代內源Trp53建立的純合敲入小鼠，該Trp53-ERT小鼠只有在Tamoxifen存在條件下，誘導Trp53的表達，並在已形成腫瘤小鼠模型的基礎上，研究再恢復p53功能後對已有腫瘤的影響。研究結果表明，在Eu-Myc引起的淋巴瘤基礎上，恢復Trp53活性可產生快速細胞凋亡，明顯增加小鼠的存活率。另外，多西黴素（Doxycycline，Dox）調控基因表達的可逆誘導系統也被應用於GEM模型的建立，通過該系統誘導人MYC原癌基因的表達後，引起腫瘤的形成。隨後觀察在關閉MYC基因表達，導致原癌基因失活後，已形成的腫瘤的相應反應。該研究是應用Dox的Tet-off誘導系統，持續在小鼠造血幹細胞中特異表達人MYC轉基因，誘導小鼠形成惡性T細胞淋巴瘤和急性髓系白血病，在此基礎上，如果通過添加Dox誘導劑使MYC表達停止後，發現已表現出的腫瘤表型也隨之消弱，並證實此過程與腫瘤細胞周期死亡有關。研究也發現，對於此可逆誘導系統中停止激活MYC表達後的長期效果，不同的腫瘤類型是有區別。如在骨肉瘤中短暫抑制MYC表達，因肉瘤細胞分化為成熟的骨細胞的原因，所以會出現肉瘤持續的萎縮的現象。相反，雖然MYC表達抑制會引起肝癌出現瀰漫性的萎縮，但是，存留的腫瘤細胞仍處於潛伏狀態，並在重新開啟MYC表達後，可以很快恢復其腫瘤特徵。

3. 破解自發性轉移形成機制

儘管有不斷改善的腫瘤治療選擇策略，轉移疾病仍然是引起癌症死亡的主要原因。轉移過程是通過腫瘤細胞與腫瘤微環境相互持續作用而形成的複雜多步驟過程。過去絕大數臨床前轉移研究是藉助細胞系接種模型來實施的，而這類模型不能真實反映腫瘤病人的轉移過程。GEM模型可引起原發腫瘤發展和轉移形成，因而是研究過去未知的自發轉移形成過程不可缺少的工具。由於原發腫瘤的過度生長的原因，在大範圍轉移形成之前，小鼠一般不得不被處死，這也是GEM模型潛在的不足之處。這一局限性可以通過將GEM來源的腫瘤組織進行原位移植方式解決，比如通過手術移植方式，達到保留供體腫瘤的腫瘤內異質性效果，使其轉移過程的發生接近臨床上常見轉移疾病。

應用GEM模型研究腫瘤轉移過程已獲得了某些重要的發現。過去的研究認為腫瘤轉移是發生在腫瘤形成過程晚期。然而，通過BALB-NeuT和MMTV-PyMT小鼠乳腺腫瘤模型的研究表明，來自早期損傷轉染細胞已經具有傳播至骨髓和肺組織而形成微小轉移瘤。另外，上皮細胞至間葉細胞間的轉移（EMT）被認為在腫瘤細胞傳播和轉移方面起到了非常重要的作用。然而，應用胰腺癌和乳腺癌GEM模型研究表明，腫瘤細胞不僅保留了其上皮細胞特徵，卻能在轉移病灶位置出現，提示EMT在這些模型中的腫瘤轉移形成並不是必須的。再有，在探索腫瘤轉移形成過程中，腫瘤細胞與免疫系統之間複雜關聯方面，GEM模型明顯發揮了突出關鍵作用。例如，骨髓免疫細胞，如巨噬細胞和中性粒細胞，在促進不同種癌症的轉移形成方面，起到了至關重要的作用。最近有研究報道表明，乳腺腫瘤引起系統炎癥狀態，即由IL17-產生的T細胞及繼發的免疫抑制中性粒細胞的擴增，可引發小葉乳腺癌GEM模型的自發性轉移形成，導致GEM移植模型的自發轉移疾病。

GEM模型在揭示相關基因參與抑制腫瘤轉移機制方面也發揮了重要作用。最近，劉寶華課題組應用Tet-ON可誘導Sirt7表達的GEM模型，揭示了Sirt7抑制原發胰腺癌轉移作用機制，該研究結果證實，由Dox誘導表達的Sirt7具有明顯抑制MMTV-PyMT小鼠乳腺腫瘤肺轉移的作用，且其作用機制是通過調節TGF-β信號通路實現的。

因此，GEM模型在揭示腫瘤轉移複雜性，挑戰當下普遍接受的關於腫瘤轉移是由晚期癌症細胞包括EMT在內的轉移過程理論等方面，都發揮了不可缺少的作用。這些重要發現有可能為轉移癌症病人的治療提供重要的參考依據。

4. 研究腫瘤微環境作用

在揭示腫瘤細胞外部因子如癌症相關成纖維細胞(CAFs) 和免疫細胞與腫瘤形成過程等作用方面，GEM模型已發揮了不可取代的作用。CAFs可通過合成細胞外基質（ECM）成分（如膠原蛋白，纖維連接蛋白，層粘連蛋白）來調控ECM和基底膜形成。而且，CAFs是各種可溶性介導物包括基體金屬蛋白酶（MMPs)來源, 達到促使ECM轉化，加強其在維持ECM動態平衡方面的重要作用。GEM模型研究已表明，CAFs在腫瘤形成過程中具有雙重作用。利用K4-HPV6鱗狀皮膚癌小鼠模型研究發現，在上皮細胞惡性癌轉化過程中，CAFs能通過增強炎症，血管形成，以及ECM重新組成，達到刺激腫瘤的發展的作用。

相反，通過兩個獨立的胰腺癌GEM模型研究表明，在體內抑制CAFs具有加速腫瘤形成過程，提示CAFs對腫瘤的阻止作用。如此相互矛盾的現象對於免疫細胞則是可以理解的，起初免疫細胞被認為是可通過攻擊轉化的細胞，達到抑制腫瘤形成過程。然而，最近的研究表明，這些免疫細胞也具有促進腫瘤的功能。應用小鼠模型對一些不同的腫瘤類型的研究已揭示了炎症與腫瘤之間的相互關係。例如，應用大腸炎相關癌症的小鼠模型，在髓系免疫細胞中特異性敲除NF-jB信號系統後，降低小鼠腫瘤生長，表明其具有促進腫瘤作用。

另外，K4-HPV6小鼠模型研究也表明，肥大細胞與骨髓來源細胞藉助MMP9激活血管生成和重新調整基質結構等方式，發揮其促進鱗狀皮膚癌形成作用。應用同樣的皮膚癌症模型發現，慢性炎症有促進新生腫瘤形成的作用。至此，人們已經開始了對炎症誘導腫瘤相關巨噬細胞和中性粒細胞的促進作用進行研究。例如，在MMTV-PyMT乳腺癌小鼠模型基礎上，將一種重要的巨噬細胞相關基因CSF1 （Colony-stimulating factor1 ）敲除後發現，該小鼠的乳腺腫瘤惡性化過程被延緩。同樣，抑制CXCR2（一種介導中性粒細胞遷移的趨化因子）則有抑制APC小鼠的腸道腫瘤形成的效果。總之，這些研究強調了免疫細胞在腫瘤發生與發展過程中，發揮了一起協同參與調控的作用。

5. 確定腫瘤細胞的來源

揭示腫瘤發生過程中的細胞來源將為開發與改善治療策略提供非常重要的理論基礎。應用GEM模型已經成功闡明了某些不同腫瘤類型的細胞起源。在小細胞肺癌（SCLC）研究中，通過氣管內注射細胞特異性的Adeno-Cre病毒載體，使Trp53和Rb1兩基因分別在Clara細胞, 神經內分泌的（NE）細胞，以及II型肺泡（SPC）細胞在被特異性敲除，分析腫瘤發生不同時間和腫瘤表型等。結果表明，相對於SPC細胞，NE細胞是造成SCLC形成的細胞來源。另外，細胞來源的研究也能提供與以前研究結果不一樣的意外結果。比如，過去以BRCA1為基礎的乳腺癌研究認為，該類癌症的來源細胞是基底上皮幹細胞。而應用GEM模型對BRCA1引起的基底樣乳腺癌研究中發現，其實管腔祖細胞才是基底樣腫瘤的真正來源。

最近來自兩個不同實驗的研究結果表明，遺傳變異（如Pik3ca突變）可顯著地影響幹細胞庫組成。Pik3ca點突變（如H047R）引起具有譜系特徵的乳腺上皮細胞分化為多能幹細胞樣狀態能力損失。而且，Pik3ca乳腺腫瘤的細胞來源主導了其惡性程度，表明了在改善抗癌症藥物及治療效果的特異性方面，準確找到腫瘤細胞來源具有非常重要的實際意義。

6. 驗證新藥物靶點

考慮到不是所有的癌基因都是維持腫瘤形成必須的，因此，在針對相應靶點藥物，開展人體臨床試驗前，即在臨床前的動物體內，驗證滅活TSG，或者降低致癌基因是否能引起進行中腫瘤的萎縮成為非常重要的試驗。應用可誘導小鼠模型可實現對致癌基因維持腫瘤相關性的驗證，如在乳腺癌小鼠模型中，癌基因Pik3ca表達去誘導後，引起部分腫瘤的萎縮，提示這些腫瘤是「依賴」廣泛性活性P13K信號密切相關的。然而，多數腫瘤最終因Met或Myc增加而複發，提示這些遺傳損傷可能會誘導對P13K抑製劑的耐受性。此例子說明可誘導GEM模型應用於臨床前研究，不僅可達到驗證藥物靶點的目的，而且對揭示藥物耐受性的形成機制也具有其實際意義。

TSG也有可能成為有效的藥物靶點。由於p53基因的顯性負作用或抑制突變，以及其特異性抑製劑MDM2和MDM4的增加/過表達等的原因，導致腫瘤中的p53功能喪失。應用可逆轉抑制p53活性的GEM模型遺傳學研究表明，重新恢復p53基因功能，可快速使已形成的腫瘤消退，提示研製針對抑制MDM2分子，從而恢復p53功能，或將突變型p53重新恢復為具有野生型功能p53的抗腫瘤藥物臨床意義。同樣，應用可誘導敲低APC的GEM模型研究結直腸癌結果也表明，誘導恢復APC功能後，可迅速引起快速與廣泛腫瘤細胞分化和持續的無複發萎縮，這為體內評價APC/Wnt通路作為APC突變引起的結直腸癌的治療靶點提供了依據。

7. 闡明治療效應與耐受

為了將臨床試驗中抗腫瘤新療法失敗的風險盡量降低到最低，建立臨床前高效及預測性強的體內模型，客觀評估相應藥物效應及耐受性就顯得更加重要。通過Kras突變引起的肺癌和胰腺癌的GEM模型研究發現，GEM模型對靶向治療和傳統化療的應答效應與相應病人的應答性具有非常大的相似性。需要加以關注的是小鼠與人在藥物代謝方面卻表現明顯不同，比如，參與肝臟藥物代謝的細胞色素P450酶底物特異性方面，不同的物種存在較大的差異。該類問題可藉助人源化小鼠模型加以解決。因此，建立人源化的GEM模型作為臨床前藥物效果的研究，將有助於優化針對靶特異抗腫瘤藥物的研發，以及尋找與確定治療效應的關鍵因素，並使其成為腫瘤病人特徵的預測性生物標記。另外，GEM模型也可應用於探索治療敏感性腫瘤獲得性耐葯的形成機制。

在探討腫瘤治療效應與耐受機制方面，K14cre; Brca1-f/f; Trp53-f/f (KB1P) 小鼠是作為BRCA1突變乳腺癌臨床前GEM模型的一個非常有說服力的例子。KB1P小鼠可形成完全模擬類人BRCA1突變乳腺癌組織病理學特徵的乳腺腫瘤，而且，對含鉑類藥物和PARP抑製劑也具有高敏感性。臨床試驗證實，PARP抑製劑Olaparib可以治療卵巢腫癌，乳腺癌和結直腸癌。 雖然該藥物並不對所有這類癌症病人治療都有效果，但其對BRCA1突變攜帶者表現有明顯治療效果，這可能與PARP抑製劑合用引起的協同致死作用與BRCA1缺乏有關。BRCA1突變細胞對PARP抑製劑表現為更加容易被損傷，因為PARP抑製劑誘發的單一鏈DNA斷裂，可導致DNA複製時的雙鏈斷裂，造成BRCA1缺失細胞無法實施同源重組機制來修復損傷的DNA。

根據Olaparib在臨床試驗中獲得的理想效果，FDA於2014年12月批准了該藥用於BRCA1/2突變卵巢癌病人的治療。儘管病人對該藥物有很好的反應效果，然而，在病人和GEM模型研究中都發現了獲得性藥物耐受性。通過臨床前KB1P小鼠模型研究證實，這類耐葯機制與藥物運輸物及同源重組恢復等數量的增加有關。這些研究結果有助於了解臨床上耐藥性的產生, 以及設計針對Olaparib耐葯病人的改進治療策略。

關於腫瘤治療效應與藥物耐受性的關係，現在也是逐漸比較清楚，即其影響不僅受腫瘤細胞自身因素，而且與成纖維細胞和免疫細胞等基質因素有關。通過PDAC的GEM模型進行腫瘤干預研究結果表明，治療是抑制旁泌性相關信號通路，降低促結締組織增生腫瘤基質，增加腫瘤脈管系統，導致促進抗腫瘤藥物導入腫瘤部位的過程。然而，關於攻擊PDAC中腫瘤基質的概念，最近有來自兩個研究對該理論進行了挑戰。此兩研究結果表明，基質因素可能通過阻止腫瘤血管形成，引起不是促進而是抑制PDAC生長。所以，這些研究都揭示了腫瘤微環境在治療耐受性方面，發揮了比過去想像的更加重要的，且複雜的作用。

8. 腫瘤免疫治療

在過去十年，通過對免疫反應的深刻揭示與認識，建立了利用病人免疫系統攻擊腫瘤的治療策略。近年來的黑色素瘤和肺癌臨床病人試驗已證實，包括抗CTLA-4和抗PD-1的免疫檢查點抑制物，對增強病人有效抗腫瘤免疫及改善生存率等方面具有巨大潛力。這些臨床試驗基礎是來自過去幾十年在實驗小鼠模型上開展的基礎研究，從而揭示了CTLA-4和PD-1在阻止免疫反應中的重要性，特別是通過對CTLA-4和PD-1敲除小鼠出現嚴重與溫和程度的自發性自身免疫表型的明確證實。應用CTLA-4抑制物引起接種腫瘤小鼠的抗腫瘤T細胞反應增加，產生腫瘤排斥作用，提示釋放T細胞上的剎車可能是抵抗腫瘤的一個潛力的應對策略。儘管如此，同時也應該清楚的了解，仍有一定比例的病人對此類免疫治療沒有反應，且目前的挑戰是還不知道其真正原因。

目前，雖然絕大部分的免疫學研究都是基於腫瘤移植小鼠模型的基礎上進行的，但就現在研究情況預測表明，今後GEM模型應用於該領域的研究將會越來越增加。應用GEM模型研究的部分結果表明，在新形成的腫瘤過程中，因腫瘤引起的耐受機制，T細胞喪失去其對腫瘤細胞的反應性，特別明顯的是，如果將來自GEM模型小鼠形成的腫瘤細胞，接種至免疫缺陷小鼠體內，腫瘤會快速生長，而野生小鼠則能排斥這些腫瘤細胞。提示這些腫瘤細胞沒有失去其免疫原性，T細胞仍然能識別這些細胞並發揮其攻擊作用。但在原發腫瘤小鼠的體內這些T細胞卻無能為力。

腫瘤常常被認為是慢性炎症的結果，這種炎症可引起局部和系統免疫抑制，從而不利於T細胞發揮其有效的功能。而且，腫瘤常表現為樹狀突細胞（DC)功能缺失，導致T細胞啟動缺損。例如，在MMTV-PyMT乳腺腫瘤小鼠模型中發現，原本具有潛在激活抗腫瘤T細胞的DC細胞，會被大量存在的巨噬細胞競爭抑制，這些巨噬細胞起到了阻止特定T細胞激活的作用。最近的研究也證實，促進DC細胞功能或阻止骨髓細胞引起的免疫抑制，可以達到改善免疫檢查點抑制物的抗腫瘤效果。因此，對腫瘤病人實施耐受T細胞免疫激活療法的時候，結合應用針對改善免疫抑制或則增強T細胞啟動的靶點藥物，在臨床上可能會起到更好的治療效果。

相對於腫瘤接種模型，應用GEM模型進行免疫治療研究需要不同的方法。考慮到GEM模型中腫瘤是在每個獨立小鼠體內發生的，如同病人腫瘤的發生過程，具有特殊的腫瘤抗原。因而，具有其異質性的特點，從而確保區別鑒定反應和非反應腫瘤之間的分子不同，也有助於臨床預測的生物標記物的建立。然而，對於大多數GEM模型來源的腫瘤，辨認可被T細胞識別的表達腫瘤抗原卻是未知的。為了克服這點，可藉助基因修飾的方式，將臨床上相關腫瘤抗原引入小鼠體內，使其具有誘發腫瘤特異性T細胞反應的效果。比如，應用低免疫原性的腫瘤（如肉瘤和肺癌）將腫瘤特異性抗原引入至GEM模型後，這些腫瘤的免疫原性增加，引起潛在而短時間的抗腫瘤T細胞反應。起初的抗腫瘤T細胞反應很快發生，然後是可調控T細胞介導的免疫抑制。因此，這些模型將有助於目前與未來相關研究，以達到揭示免疫逃逸的複雜機制，最終研發具有改善的腫瘤免疫治療的新策略。

9. 與臨床試驗並行的GEM模型

最近推出的「與臨床共試驗」 範例，目的是將臨床前GEM實驗與人體臨床試驗同時開展，從而達到預測治療效果的作用。該策略已經應用於前列腺癌治療中，並成功揭示了由雄性激素誘發的耐受性是其中遺傳關鍵因子，以及在克服去勢難治性的新綜合療法。同樣，應用NSCLC的GEM模型一起臨床試驗表明，Kras/Lkb1突變肺癌較Kras or Kras/p53突變腫瘤對臨床上的Docetaxel和MEK抑製劑Selumetinib的聯合療法，表現為更加具有耐受性。揭示了LKB1是臨床試驗中對此類藥物聯合療法耐受潛在決定因素。這類研究表明，應用GEM模型作為人腫瘤臨床前藥物效果研究，能發現新的生物標記物和聯合療法。

GEM在腫瘤學研究中發展趨勢與未來展望

許多抗腫瘤藥物在臨床試驗中未能達到臨床前實驗的期望目的，已經成為目前腫瘤學與轉化癌症醫學所面臨的巨大挑戰，如何改善腫瘤學領域的臨床前研究結果的預測性，也是人們十分關注的熱點。因此，如何選擇更能真實反映人腫瘤疾病發生髮展過程的臨床前腫瘤動物模型，將顯得更加重要了。為了實現這一目的，首先需要考慮的是如何建立能真實反映腫瘤本身及外在特徵的臨床前小鼠模型。比如，臨床前模型應該含有病人特異性突變，該種突變具有誘發惡性腫瘤的趨勢，且在一定病人群中顯示遺傳變化特徵。另外，原發的腫瘤過程是在自然微環境中進行的，如同在人腫瘤進行過程中所見的腫瘤細胞與腫瘤微環境之間相互作用（包括免疫細胞，成纖維細胞，以及淋巴細胞和血管的潛入）。再有，由於絕大多數進入臨床試驗的病人已經是處於廣泛腫瘤轉移疾病過程中，因此，實驗設計時就應該考慮選擇能模擬病人疾病不同進程狀態的小鼠模型，開展相應的臨床前的藥物效果評估研究。在現實的臨床試驗中，往往進入臨床試驗的病人之前多是經過不同程度的治療，因而極有可能會干擾治療效果的驗證。而臨床前的動物研究則是建立在從來沒有接受如何治療基礎上進行的，從而導致高估治療效果的結果。從另外一方面講，臨床試驗中對那些接受過治療的嚴重病人沒有效果，卻仍有可能對沒有接受過治療的嚴重病人有益處。

最近基因修飾模式動物技術的進展，促進了快速研製更加精準的能引起原發腫瘤的小鼠模型，該類模型結合了特異性腫瘤病人形成發生髮展過程中腫瘤細胞本身和細胞外特徵。預測這些新一代的GEM模型和基於GEM模型的移植模型，將是作為真實模擬病人腫瘤發生髮展過程，研究自發性轉移疾病最佳模式動物。這些模型可作為研究腫瘤形成的複雜過程（包括腫瘤的起始，器官特異性轉移的形成，腫瘤微環境的參與等方面）的重要而有用工具。但是，對於腫瘤病人而言，更加重要的是，這些模型能更為深入揭示免疫治療中反應性與耐受性，以及疾病的複發等相關機制。期待未來，應用新一代GEM模型對抗腫瘤新藥物臨床前的評估研究，將會增加預測其在臨床試驗中的成功率，從而加速設計抗腫瘤新葯策略與臨床實施，達到改善防治腫瘤病人的最終目的。

文章作者：

俞曉峰 博士

賽業生物高級科學家、賽業模式動物高級副總裁

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