乾貨系列——ITC操作手冊

應用範圍

蛋白質-蛋白質相互作用（包括抗原-抗體相互作用和分子伴侶-底物相互作用）；蛋白質摺疊/去摺疊；蛋白質-小分子相互作用以及酶-抑製劑相互作用；酶促反應動力學；藥物-DNA/RNA相互作用；RNA摺疊；蛋白質-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-細胞相互作用；

實驗時間較短（典型的ITC實驗只需30-60分鐘，並加上幾分鐘的響應時間），操作簡單（整個實驗由計算機控制，使用者只需輸入實驗的參數，如溫度、注射次數、注射量等，計算機就可以完成整個實驗，再由Origin軟體分析ITC得到的數據）。

測量時不需要製成透明清澈的溶液，而且量熱實驗完畢的樣品未遭破壞，還可以進行後續生化分析。

操作步驟簡單，總結起來就是上樣前洗滌反應池以及上樣針、設定程序開始反應以及數據收集、上樣後洗滌反應池以及上樣針、數據處理

一。洗滌

1.取出清洗連接器，將其插入到反應池中，上端與廢液瓶（錐形瓶）相連，廢液瓶與泵相連。將洗瓶中加滿水，連接器一端放入洗瓶中。

2.打開泵，將蛋白與配體及其相應buffer放入真空室中，蓋上蓋子。點擊左下角界面，點擊On為抽真空，點擊clean為清洗。

3.取出上樣針（針與針管分別放在存放盒中，拿出擰上即可）與滴定針，用水吸打至少50次。

4.清洗1-2個錐形瓶體積（約900ml），點擊clean,將連接在泵後的廢液瓶管口拔出，再將廢液瓶中廢液倒出。

二、上樣及參數設置

1.用上樣針將反應池中多餘廢液吸出，用buffer潤洗上樣針1-3次，再吸取buffer潤洗反應池1-3次，全部吸出。

2.用上樣針吸取300ul（體積可調整，最多500ul）蛋白至反應池中（吸取時注意不要有氣泡）。

3.用去離子水潤洗上樣針3-5次，潤洗後的上樣針吸取去離子水加入到參比池內，使水剛好溢出參比池口。

3.將黑色手柄垂直插入反應池上方，擰緊（有卡槽，放入時需將帶刻度一面偏右，邊向下插入邊向左擰緊至卡槽剛好卡住）。

4.打開電腦及NANO ITC儀（也可一開始打開），點擊電腦桌面上LunchITCRun,彈出界面點擊確定直至參數設置界面。（注意：在參數設置界面時，黑色手柄中刻度尺會開始校準，需要一定時間）

5．設置參數，一般為默認值（溫度：25℃，滴數：25滴，滴定間隔：120s）,可根據實驗情況做調整。

6.參數設置左下角需填寫滴定針中樣品濃度與反應池中樣品濃度。

7.待右上角三角形變綠（即黑色手柄刻度尺校準完成）後，將黑色手柄取出。

8.滴定針用buffer潤洗1-3次，再吸取樣品50ul（注意不要有氣泡），將滴定針放進黑色手柄內，擰緊。再將帶有滴定針的黑色手柄插入反應池上方，擰至卡槽卡住。

10.開始後彈出頁面為保存路徑與填寫文件名。

11.將上樣針用水洗10次左右，針與針管分離，分別放入存放盒中。

三、結束後清洗

1.待反應結束後，將黑色手柄取出（注意慢慢垂直取出，不要讓滴定針碰撞反應池，以免滴定針歪）。

2.將上樣針取出安裝好，吸出反應池中液體，按清洗步驟清洗。

3.用上樣針將反應池中殘留液體吸出。

4.清洗完成後，將滴定針與上樣針分別放入存放盒放好，黑色手柄插入反應池上方。

5.關閉泵，NANO ITC儀。

6.在保存路徑中找出文件利用Lunch NanoAnalyze進行數據分析。

7.關閉電腦，清理桌面。

操作注意事項

一、操作相關

1.上樣針針頭較長較細，清洗及上樣時需注意盡量不要抵住較硬物體，以免弄斷。

2.清洗連接器連接好後，若沒有壓水至廢液瓶中，請檢查各部件是否密閉連接。

3.廢液瓶中廢液不得太多，以免被壓至泵中，對泵造成損害。

4.在清洗之前應準備好樣品，放入真空室中抽真空排氣泡，可邊清洗邊抽真空。先點擊On,再點擊clean。

5.各部件不用時需放入存放盒中，避免損壞。

6.黑色手柄帶滴定針插入反應池上方時一定要垂直放入，拔出時也要慢慢垂直拔出！

二、實驗相關

1.蛋白與配體buffer環境保持一致，如（1）存在DTT會干擾其真實的反應吸/放熱量（2）蛋白與配體PH不一致時，酸鹼滴定放熱量會干擾蛋白本身的反應吸/放熱量

2.蛋白與配體使用摩爾濃度

3.反應池中一般放300ul樣品，滴定針中一般放50ul樣品，當滴定數據不好時，可適當調整蛋白與配體的摩爾濃度

4.參比池一般放入300ul水，不用重新吸出，不要放入其他溶液

5.當ITC滴定圖雜亂時，可能是反應池未清洗乾淨，可適當用洗滌劑清洗，2ml洗滌劑加水至200ml,後多用水清洗

6.溫度、滴數、滴定時間間隔，滴定針轉速等一般為默認值，盡量不要自行調整，若實驗需要可適當調節。

特別感謝：周夢琦同學提供相關資料及經驗分享

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