中美合作開發出新型除草劑——專家點評

本文經授權轉載自BioArt植物（bioartplants）

雜草會嚴重威脅作物產量，給農業生產造成巨大經濟損失【1, 2】。與人工除草相比，除草劑具有經濟、快速、高效等優點，為農業的高產和穩產提供了重要保障。然而，近年來，長期、單一、廣泛使用除草劑，導致了抗性雜草個體和種群逐年增加【3, 4】，降低了除草劑的防治效果，增加了雜草防治成本；同時，除草劑使用劑量增加也易造成農作物藥害風險和環境污染。目前，雜草抗性問題已經是威脅糧食作物生產的重要問題之一。因此，開發安全性高、效率高的新型除草劑具有重要意義。

天然產物小分子與生物在自然界中共同進化，其生物學活性能夠干預特定細胞的代謝途徑，因而在醫藥健康及農業生產中起著非常重要的作用，如抗菌藥物青黴素、抗瘧疾藥物青蒿素以及降脂藥物洛伐他汀等【5, 6】。因此，開發和應用具有新型生物學活性的天然產物對生命科學、醫學及農業科學等廣大領域具有重要意義。到目前為止，要發掘具有優異活性的天然產物，靠的主要是以生物學活性為導向的高通量篩選。然而，隨著後基因組時代的到來，如何綜合利用生物信息學以及合成生物學等方法，從大量的基因組序列信息來發現具有新型生物學活性的天然產物成為亟待解決的難題。

2018年7月11日，美國加州大學洛杉磯分校唐奕教授課題組、Steven Jacobsen教授課題組和上海有機化學研究所周佳海研究員課題組聯合瑞士的袁曙光博士在Nature雜誌在線發表了題為Resistance gene-directed discovery of a natural-product herbicide with a new mode of action的研究論文。該研究運用以抗性基因為導向的基因組挖掘技術成功發現了一種新型天然產物除草劑aspterric acid (AA)，通過靶向植物支鏈氨基酸合成途徑(BCAA)中的二羥酸脫水酶（DHAD)而抑制植物的生長。該研究首次解析了DHAD全酶的結構，並利用計算化學闡明了AA與酶活性中心的結合機制，揭示了新型除草劑產生效能的分子機制。同時，利用產生菌自身的抗性基因，成功構建了具有AA耐受性的轉基因作物。該工作不僅為挖掘基因組尋找天然產物提供了新的方法和啟示，同時也為探索農業生產中開發新型除草劑提供了範例。

支鏈氨基酸（branched chain amino acid,（BCAA），包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）是植物生長必需的營養成分，其生物合成途徑由三個酶組成：乙醯乳酸合酶（ALS）、乙醯羥酸異構還原酶（KARI）和二羥酸脫水酶 (DHAD)。DHAD在BCAA途徑中催化α,β-二羥酸脫水反應生成亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸的前體α-酮酸。這個參與植物必須氨基酸合成的酶DHAD在不同的植物物種中高度保守，即使在進化遠端的植物中依然有80%的同源性。哺乳動物體內不存在BCAA生物合成途徑，它們依靠食物攝取這些三種必須氨基酸，因此DHAD被認為是理想廣譜除草劑的靶點【7】。早在20年前，杜邦公司的科學家們就曾成功地設計出了針對DHAD的小分子抑製劑，然而當將其施用在植物體時，這些化合物分子卻無法抑制植物的生長。

天然產物與生物體在自然界中共同進化，產生具有能夠干預特定細胞代謝途徑的生物學活性，因此，在自然界中可能存在抑制必需氨基酸合成途徑上DHAD的天然抑製劑。基於這一假設，唐奕課題組推測這樣的天然抑製劑生物合成基因簇必然包含一個編碼DHAD同源蛋白的基因。這個DHAD同源蛋白對於抑製劑不敏感，可以提供給生產者耐受這種抑製劑的能力，使生產者在合成這種抑製劑的同時，自身可以生存下來。通過篩查已公開的所有真菌基因組，研究人員找到了一個與DHAD同源基因和天然產物合成基因連鎖的保守基因簇。這個保守基因簇由四個基因構成，這四個基因分別編碼倍半萜環化酶同源蛋白AstA，兩個細胞色素P450氧化酶(AstB和AstC)，以及一個DHAD的同源蛋白(AstD)。通過在酵母中異源表達astA,astB,astC基因，他們發現這個簇的最終產物為aspterric acid (AA)。

Genome mining of a DHAD inhibitor and biosynthesis of aspterric acid.

AA雖然是一個已知化合物，但由於人們對其生物學活性產生的機制不了解，這個天然產物自首次被分離40多年以來一直為人們所忽視。唐奕課題組通過抗性基因為導向的基因組挖掘策略發現了這個被人們忽視的小分子，並利用生物化學手段證明了AA的生物學活性。同時，研究人員也證明了AstD具有DHAD的功能，卻對AA具有極高的耐受性。儘管AA可以很好的抑制DHAD的活性，但是否能夠很好的抑制植物生長是開發新型除草劑的關鍵。通過對模式植物擬南芥、單子葉植物玉米和雙子葉植物番茄的抑制實驗，唐奕課題組和Steven Jacobsen課題組進一步證實了AA對於植物生長具有廣譜的抑制性。

Aspterric acid is a plant growth inhibitor.

周佳海課題組對DHAD全酶結構進行了首次解析，結合計算化學手段，AA與酶活性中心的結合機制，以及AstD具有AA耐受性的分子機制也被闡明。研究發現，具有特殊三環結構的AA可以模擬天然底物α,β-二羥酸與活性中心二鐵二硫簇和鎂離子的結合模式，並且能夠通過具有較大位阻的三環結構及側鏈，與活性中心入口處疏水氨基酸殘基發生疏水作用，以更高的結合能與DHAD的活性中心結合。

X-ray Structure of holo-AthDHAD and homology model of AstD.

為進一步使AA在除草的同時不影響作物的生長，研究人員將抗性基因AstD在擬南芥中表達，並成功獲得可以耐受高濃度AA的轉基因植株。這一結果表明，可以利用AstD抗性基因開發具有AA耐受性作物，從而實現利用AA進行專一性除草，而不影響作物的目的。這一工作不僅為挖掘基因組尋找天然產物提供了新的方法和啟示，同時也為探索農業生產中開發新型除草劑提供了範例。

Aspterric acid-resistance ofArabidopsisplants expressingastDtransgenes.

唐奕課題組的博士生Yan Yan、Steven Jacobsen課題組的博士後Qikun Liu和周佳海課題組的碩士生臧鑫並列論文第一作者。該工作得到了中科院先導B項目的資助，晶體衍射數據是在上海光源BL19U收集的。

參考文獻

1. Soltani, N. et al. Potential corn yield losses from weeds in North America. Weed Technol. 30, 979–984 (2016).

2. Swanton, C. J., Harker, K. N. & Anderson, R. L. Crop losses due to weeds in Canada. Weed Technol. 7, 537–542 (1993).

4. Heap, I. Global perspective of herbicide-resistant weeds. Pest Manag. Sci. 70, 1306–1315 (2014).

5. Dayan, F. E. & Duke, S. O. Natural compounds as next-generation herbicides. Plant Physiol. 166, 1090–1105 (2014).

6. Clardy, J. & Walsh, C. Lessons from natural molecules. Nature 432, 829–837 (2004).

7. Amorim Franco, T. M. & Blanchard, J. S. Bacterial branched-chain amino acid biosynthesis: structures, mechanisms, and drugability. Biochemistry 56, 5849–5865 (2017).

專家點評

唐功利（中科院上海有機化學研究所研究員，中科院「百人計劃」，國家傑出青年基金獲得者，國家「萬人計劃」中青年科技創新領軍人才）

微生物來源的天然產物（也稱為次生代謝產物）一直是新葯發現的重要源泉，在抗感染、抗腫瘤治療及農用抗生素等領域尤其受到關注。然而發現新結構或新功能的化合物卻面臨越來越多的困難。興起於上世紀八十年代的天然產物生物合成及組合生物合成研究，得益於九十年代基因組研究帶來的技術進步而得到了蓬勃發展；進入二十一世紀，特別是隨著合成生物學的興起與迅猛發展，完全改變了人們發現天然產物的模式。於是，一種以生物信息為指導、從基因到化合物的全新天然產物發現模式誕生了。該方法不僅可以排除大量已知化合物的干擾，更重要的是可以發掘生物體及環境DNA中特定的沉默基因（簇），極大地拓展天然產物的發現空間。然而，如何定向發現有特定生物學功能的高活性天然產物仍然具有很大的挑戰。

微生物對次生代謝產物的抗性是一種古老的自然現象，它們通過進化出對應的抗性基因來保護自己免受所產生的生物合成中間體及產物的傷害。而這些特定地抗性基因多數情況下是與其生物合成基因簇連鎖在一起的，特別是對高活性和獨特作用機制的化合物而言更是如此。之前科學家曾通過抗性基因介導來發現微生物中產生的抗菌活性化合物，而該工作巧妙地將天然產物的自抗性與酶抑製劑的發現及農藥研髮結合起來，實現了抗性基因介導的天然產物挖掘-化合物功能驗證-靶標與抑製劑作用機理-除草劑研發的全鏈條、從生物信息指導到新功能農藥的發現。

這篇文章不僅報道了以抗性基因為導向的基因組挖掘策略發現了aspterric acid (AA) 這個小分子的生物學活性，即它能夠高效結合併抑制DHAD蛋白（植物支鏈氨基酸合成途徑中的二羥酸脫水酶）達到除草的目的，還研究了針對新型的除草劑研發靶點二羥酸脫水酶(DHAD)的結構、催化機制以及抑製劑分子AA的抑制作用。更重要的是從天然產物生物合成的視角出發，發現天然抑製劑AA生物合成基因簇包含了一個編碼DHAD同源蛋白的AstD基因，AstD對於抑製劑AA不敏感，它的存在可以抵消AA對DHAD的抑制而不影響植物中亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的生物合成。將AstD導入模式植物擬南芥和番茄等經濟植物中表達後，可以成功獲得耐受高濃度AA的轉基因植株，結果表明AstD可以協助抑製劑AA進行專一性除草並且具有不傷害作物的功效。

大力研究開發天然除草劑和以天然產物為先導化合物的、作用機理獨特的除草劑是環境保護和農業可持續發展所必需的，除草劑不僅要考慮如何更有效地殺滅雜草外，還要以適應環境、安全無公害為出發點，做到選擇性強，作用機理獨特，安全高效，對環境和人類的影響極小。因此，該工作不僅是如何發現特定生物學功能的高活性天然產物的一個成功範例，更重要的是為全新作用機制的天然除草劑開發開拓了全新的領域。

張長生（中科院南海海洋研究所研究員，中科院「百人計劃」，國家傑出青年基金獲得者，國家「萬人計劃」領軍人才）

DHAD抗性基因：發現新型除草劑的利器

生物活性指導是從微生物中發現活性天然產物的傳統方法，引導了抗菌藥物青黴素和降脂藥物洛伐他汀等的發現和臨床應用。但這種經典方法在發現活性天然產物方面也存在局限性，需要相應篩選模型的建立及海量的篩選，耗費大量財力人力，效率較低。依據基因組信息指導的天然產物化學研究逐漸發展成為發現活性天然產物的一種新模式，但如何從海量的微生物基因組資料庫中鎖定生物合成基因簇（BGCs），引導活性天然產物的精準發現，仍是生物學家、藥物化學家及藥理學家等廣泛關注、亟待解決的難題。

近日，加州大學洛杉磯分校的唐奕教授、Steven E. Jacobsen教授和中國科學院上海有機化學研究所周佳海研究員在Nature聯合發表了題為Resistance gene-directed discovery of a natural product herbicide with a new mode of action的研究論文，報道了在抗性基因指導下，利用基因組挖掘技術，精準發現新型除草劑aspterric acid （AA）。

唐奕教授課題組通過基因組挖掘在許多真菌內發現一個天然產物生物合成基因簇(astABC)與一個二羥酸脫水酶DHAD同源基因（astD）連鎖在一起，並且通過異源表達絲狀真菌Aspergillus terreus中的astABC證實其編碼已知化合物aspterric acid (AA)。同時，他們證明AstD具有DHAD的功能，卻能耐受高濃度AA。AA在十多年前已被發現對植物擬南芥具有抑制功能，但其作用機制一直不清楚。基於天然產物的結構基因通常和抗性基因成簇存在的特性，唐奕課題組大膽假設AA能抑制植物中DHAD的功能。在這種思路的引導下，唐奕課題組和Steven Jacobsen課題組證實了AA是DHAD的高效抑製劑，對於多種植物的生長具有廣譜抑制活性，從而首次發現DHAD也可以作為新靶點用於除草劑的研發。有趣的是，AA與一線除草劑草胺膦協同使用，可以高效殺滅草胺膦抗性擬南芥。周佳海課題組解析了擬南芥中DHAD的全酶結構，結合模擬計算闡明了AA與DHAD酶活性中心的結合機制以及AstD耐受AA的分子機制。最後，研究人員將抗性基因astD在擬南芥中表達，獲得了能夠耐受高濃度AA的轉基因植物。

總之，這項研究在抗性基因指導下從微生物中發現了新型除草劑aspterric acid （AA），為精準闡釋天然產物的生物學功能提供了新的策略，是後基因組時代活性天然產物研究與應用的成功範例。AA抗性基因astD轉基因植株成功構建，預示了AA作為新型除草劑的廣闊的應用前景。

通訊作者簡介

唐奕

唐奕，美國加州大學洛杉磯分校校長冠名教授。1997年，賓夕法尼亞州立大學化學工程、材料科學與工程 學士學位。2002年 ，加州理工學院化學工程獲得博士學位。2002-2004：斯坦福大學博士後。2004-2008：UCLA化學與生物分子工程系助理教授。2008-2010：UCLA化學與生物分子工程系副教授。2010- 美國加州大學洛杉磯分校（UCLA）化學與生物分子工程系和化學與生物化學系教授。

唐奕教授主要從事天然產物的生物合成和生物催化研究。在合成生物學領域卓有建樹，是國際上本領域具有國際影響力的領軍人物之一，尤其在真菌的生物合成領域，取得了多項突破性的學術成就。唐奕教授系統解析了多個真菌聚酮類藥物生物合成機理，首次破解了抗生素四環素起始合成之謎，深入闡釋了真菌非核糖體多肽合成中複合酶大環環化模塊的化學催化機制，揭示了降血脂藥物洛伐他丁的生物合成機制並應用於工業生產辛伐他汀，成功構建了在大腸桿菌和真菌中重組表達真菌聚酮複合合成酶與多肽合成複合酶的技術體系。研究成果在Nature、Science 、Nature Chemical Biology 、 J. Am. Chem. Soc. 、 Angew. Chem. Intl. Ed. 、PNAS等高水平專業期刊上發表論文80餘篇，其中IF 10以上文章30餘篇，H指數34，他引3649次。獲得包括總統綠色化學挑戰獎、美國化學學會Author C. Cope獎等10餘項美國獎勵，授權國際專利7項。主持美國科學基金、NIH和David-Lucile Packard基金等各類研究基金8項，是國際著名的生物化學家和合成生物學家。

周佳海

周佳海，中科院上海有機所研究員。1993年畢業於南京大學少年班化學專業，在南京化工廠工作以後考入中國科學院上海有機化學研究所碩博連讀，2000年獲理學博士學位。2001-2006年在美國密西根大學進行博士後學習，2006年9月加入中國科學院上海有機化學研究所生命有機化學國家重點實驗室擔任課題組長，2008年獲中國科學院「百人計劃」擇優支持。

周佳海實驗室主要研究方向是微生物酶學，通過會聚酶學、結構生物學及蛋白質理性設計等技術方法，重點研究酶的結構與催化機理、機制與分子改造以及酶定向進化的科學規律等，最近5年在Nature Chemical Biology、PNAS、J Am Chem Soc、Angew Chem Intl Ed、Nature Communications等知名期刊上發表論文多篇。

Steven E. Jacobsen

Steven E. Jacobsen現為加州大學洛杉磯分校分子、細胞與發育生物學系終身教授，HHMI (Howard Hughes Medical Institute) 研究員，美國科學院院士，美國藝術與科學院院士。Steven E. Jacobsen長期以來專註於植物表觀遺傳學的研究，其研究成果發表在Science, Nature, Cell, PNAS, Nature Plants, Plant Cell等學術期刊上。 Steven E. Jacobsen教授現為Science編委以及美國五家生物技術公司專業顧問。

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