三代測序助力人類基因組DNA 6mA甲基化研究
導
讀精
近日，中山大學中山眼科中心肖傳樂教授、廣州醫科大學附屬第三醫院晏光榮教授、中國農業科學院生物技術研究所谷曉峰研究員、北京放射醫學研究所伯曉晨研究員、美國費城兒童醫院&北京希望組首席科學家王凱教授等學者與北京希望組余國亮帶領的團隊共同合作完成的文章「N6-Methyladenine DNA Modification in Human Genome」在Molecular Cell雜誌在線發表。該研究利用三代測序技術，首次獲得了中國人DNA N6-甲基腺嘌呤（6mA）修飾圖譜，是人類基因組DNA甲基化研究領域的重大突破。
DNA甲基化是表觀遺傳調控的重要組成部分，在調控基因組印記、X染色體失活、轉座子沉默、基因表達、表觀遺傳記憶、胚胎髮育和腫瘤發生等方面發揮著重要作用。真核生物中，5mC是最常見的甲基化修飾。而在原核生物中，6mA是最常見的甲基化修飾，且6mA甲基化在限制-修飾(R-M)系統的調控、DNA錯配修復、基因表達等方面發揮了重要的作用。在早期的研究中，受技術條件的限制，並沒有在真核生物中檢測到DNA 6mA修飾，因此過去認為DNA 6mA在包括人類在內的真核生物中不存在。近年來，隨著測序技術的不斷發展，已經在萊茵衣藻、秀麗隱桿線蟲、 果蠅 、真菌等真核生物中發現了DNA 6mA的存在，並且發現6mA甲基化參與了調控基因和轉座子的表達。此外，已有大量研究表明RNA m6A修飾在人類mRNA中廣泛存在，與RNA剪接、mRNA穩定性和基因表達有關。但有關DNA 6mA修飾是否廣泛存在於人類基因組中，以及是否在基因調控和疾病致病機制中發揮作用等問題仍未得到深入研究。
近年來以PacBio SMRT和Oxford Nanopore 為代表的三代測序技術將高通量和長讀長相結合，同時具有高效、單鹼基解析度的優勢，無需額外的樣本製備，可直接獲得整個基因組範圍內的區域甲基化信息，為評估人類基因組中的甲基化提供了一個有效的方案。
本研究首先對第一個基於三代測序的亞洲人參考基因組「華夏一號」的PacBio SMRT測序數據進行分析，共發現881,240個 6mA 修飾位點，首次獲得了中國人DNAN6-甲基腺嘌呤（6mA）修飾圖譜。通過分析該甲基化圖譜的特徵，發現DNA 6mA在常染色體上的丰度較高，在X染色體和Y染色體中的丰度相對較低，且這些位點主要富集在外顯子編碼區。
各染色體上DNA 6mA的丰度分布
DNA 6mA在染色體各區域上的丰度分布
RNA 6mA已被證實對基因表達有重要的影響，但DNA 6mA在基因表達方面的潛在作用在很大程度上仍不清楚。本研究發現，高表達水平基因的外顯子區域具有較高的6mA丰度，且進一步分析發現外顯子區域的6mA丰度與RNA表達水平正相關。此外，通過對DNA 6mA丰度高的基因進行了GO富集分析發現，6mA修飾位點在G 蛋白偶聯受體(GPCR)相關基因中有顯著的富集。GPCRs作為膜蛋白受體參與多個細胞信號轉導過程，以改變細胞的狀態，且與許多疾病的發生有關，也是約40%治療性藥物的通用靶點。因此，6mA甲基化可能在GPCR相關基因表達調控中發揮重要作用，但還需進一步的研究。
m6A丰度與RNA表達水平的關係及其位置分布
此外，本研究發現和證實了DNA 6mA由N6AMT1甲基化轉移酶和ALKBH1去甲基化酶調控。為了研究DNA 6mA的功能，該研究還分析了腫瘤組織及非腫瘤組織的6mA水平。結果發現，與非腫瘤組織相比，腫瘤組織中6mA及其甲基轉移酶N6AMT1的水平呈現下調，而去甲基化酶ALKBH1的水平呈現上調。為了進一步研究DNA 6mA修飾對腫瘤發生的影響，對癌細胞中N6AMT1和ALKBH1進行過表達和沉默。結果發現沉默N6AMT1基因降低了癌細胞基因組的DNA 6mA水平，促進了癌細胞的生長，而N6AMT1過表達則以劑量依賴性方式抑制了癌細胞生長。沉默ALKBH1基因則增加了癌細胞基因組DNA 6mA水平，抑制了癌細胞的生長，而ALKBH1過表達以劑量依賴的方式逆轉了這些效應。此外，通過構建肺癌異種移植小鼠模型，也得到與上述一致的結論。因此，結果表明DNA 6mA修飾水平的降低可以促進腫瘤發生。
N6AMT1下調對腫瘤細胞增殖，遷移能力和腫瘤大小的影響
ALKBH1下調對腫瘤細胞增殖，遷移能力和腫瘤大小的影響
綜上所述，本研究首次獲得了中國人DNA N6-甲基腺嘌呤（6mA）修飾圖譜，揭示了DNA 6mA甲基化修飾在人類基因組中的調控機制，加深了人們對於DNA 6mA甲基化生物學功能的認識。
北京希望組作為全球最大三代測序應用公司、全球最大的Oxford Nanopore測序中心，致力於研發和推廣長讀長測序技術在醫學中的應用，目前已重磅推出「華夏萬人SV」，旨在構建中國健康人群高分辨基因組結構變異圖譜、單鹼基精確度的DNA甲基化圖譜，彌補目前基因組資料庫的空白，進而通過對大規模的疾病群體進行基因組結構變異分析，明確廣泛的疾病和病症相關的罕見遺傳變異，這將對中國人群基因組學研究、遺傳性疾病研究、精準醫療應用等領域產生重要的科學及臨床價值。
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