夢想照進現實：stLFR文庫製備試劑盒開放測試

圖 1 人類基因組平均1000個鹼基，會出現來自父方和母方的染色體所攜帶的鹼基信息不一致，被稱為雜合單核苷酸多態性

華大智造首席科學家Rade Drmanac 於2018年3月日本國際人類基因組大會(Human Genome Meeting,簡稱HGM)首次對外展示Single Tube Long Fragment Read （stLFR）技術, 該技術是目前最簡便的單倍體基因組測序方法。stLFR技術基於無分隔共標記的理念設計，利用磁珠表面形成數千萬個虛擬分隔，不同虛擬分隔均攜帶不同的分子標籤。經過酶反應後，高分子量DNA（long fragments）被片段化，同時來源於相同高分子量的片段化短DNA（sub fragments）被標記上相同的分子標籤，從而實現在測序後通過分子標籤還原長片段信息。

為了讓用戶更簡便使用這一技術，華大智造於2018年7月正式推出了「MGIEasy stLFR文庫製備試劑盒」，並面向全球招募首批試用客戶（感興趣的老師可掃描文末二維碼申請）。使用該試劑盒，研究者僅需10 ng DNA就可完成單倍體基因組測序，同時還能獲得SNP、InDel、CNV和SV等信息。與10X Genomics的Linked-Reads技術相比，整個操作可在一管中完成，反應無需微量自動化移液設備，無需進行MDA擴增，無需微流控液滴生成裝置和晶元，大大提高了實驗的可操作性。

圖 2 stLFR技術原理示意圖

stLFR -數據表現

測序數據評估

stLFR測序能夠在全基因組範圍內提供基因組長片段信息，包括分型、突變及基因組結構變異。能夠揭示在遺傳性疾病變中的重要遺傳信息，發現與癌症相關的關鍵性基因突變。以1ng高質量DNA作為起始，經過標記和捕獲後，再進行常規文庫構建和測序。數據顯示，stLFR相比標準版WGS和10X Genomics文庫，在測序覆蓋均一性，GC偏好性，均有較高的一致性。

圖 3 GC偏好性結果

單倍體型構建

單倍體型基因組構建是深入研究基因組，了解基因功能的基礎，而單體型定相長度與起始DNA長度呈正相關。數據顯示在stLFR文庫中，初始DNA的長度中位數約為50 Kb，最大長度可達300 Kb。評估不同測序深度下stLFR的phasing能力，HapCUT 2.0 Phasing統計結果顯示stLFR Phasing N50最大值為15.1Mb。隨著測序深度的降低，stLFR文庫的Phasing N50值仍能維持在8.6Mb以上，滿足絕大多數基因的全基因長度Phasing的需求。由於操作過程無需複雜設備，可以更低的投入獲得更全面的定相和變異信息。

表 1 stLFR Phasing數據表現

圖 4 stLFR 起始DNA長度分布

變異檢測能力

利用stLFR技術構建Haplotype，通過Co-barcoded信息尋找到NA12878細胞系8號染色體上的雜合Deletion，表明stLFR能發現常規WGS無法看到的突變信息，這也為研究複雜雜合導致的單基因遺傳疾病提供可能。同時，Co-barcoded信息也為鑒別同源基因的變異信息提供證據。

圖 5 Haplotype和Co-barcoded信息檢測等位基因上的雜合Deletion以及同源基因的突變信息

小尺度變異（SNP、InDel）檢測方面，stLFR、10X Genomics和標準WGS檢測的SNP和InDel總數基本相當。但是10X Genomics特有的變異數量高於stLFR和標準WGS，導致其檢測的靈敏度和準確度都低於stLFR。

表 2 SNP、InDel變異檢測靈敏度和準確度統計

圖 6 SNP、InDel變異檢測結果

與常規WGS變異檢測的相比，stLFR除了能檢測SNP和InDel，還可以利用Phasing和co-barcoded信息對基因組上的大尺度變異（CNV、SV）進行檢測，這些變異信息能更好的解釋惡性腫瘤發生過程中關鍵的致癌驅動事件。對NA12878中已知的SV進行檢測，檢出率能達到100%。

表 3 NA12878已報到缺失信息

圖 7 8號染色體的雜合缺失

基因組組裝

得益於文庫中數千萬個barcode，stLFR技術每個barcode內所含的DNA長片段數量大大降低，約有84%的barcode內有且僅有一條長片段DNA分子（圖5），stLFR技術的這一特質可用於輔助基因組De novo組裝。相比Hi-C輔助基因組組裝所需的數據量，stLFR只需要60 Mb的reads就能夠得到更少數量的scaffold。另外，stLFR的實驗操作簡便，成本低，更容易形成標準試劑盒產品。

表 4 stLFR和Hi-C對三代PacBio組裝結果的優化

圖 8 Barcode包含的長片段DNA分子數量分布

經過了多年的發展，全基因組測序技術和單倍體型測序方法已經得到了極大的提升，變異檢測和定相結果越來越準確，能夠定相的區域也越來越長。我們開發的stLFR技術是一種低成本，零錯誤，全長染色體定相的全基因組測序方法，並能夠對二倍體基因組進行從頭組裝，真正實現完美基因組測序。

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