中國抗艾滋葯實現零的突破，新葯研製難在哪？

導語：近期，中國自主研發的第一款治療艾滋病的多肽葯獲批上市，多肽葯會被消化系統的蛋白酶分解，所以都通過注射使用。其生物活性高、特異性強、毒性反應弱、在體內不易產生聚集、與其他藥物相互作用比較少、與體內受體親和性高，被廣泛應用於治療腫瘤、糖尿病、心血管疾病等領域。

出品| 網易新聞

作者|豬豬，清華大學醫學院博士 常松，清華大學材料學院博士

編輯| 史文慧

最近，電影《我不是葯神》的大熱引發了人們對於製藥行業從宏觀到微觀的廣泛討論和全面剖析。

（《我不是葯神》影片截圖）

其實，就在電影上映的一個月前，中國自主研發的第一款治療艾滋病的國家一類新葯艾可寧（注射用艾博衛泰）獲得國家藥品監督管理局（CFDA）批准上市，這是全球第一個長效HIV-1融合抑製劑，也是中國第一個原創抗艾新葯，擁有全球知識產權。

一款新葯從研發到臨床試驗、審批、再到工業化生產及上市，漫長的周期中有太多問題可以探討。今天，我們就來從技術層面上聊聊，像艾可寧這樣的多肽葯的製造工藝和發展問題。

（一）抗艾葯是怎樣「戰鬥」的？

HIV作為逆轉錄病毒，其組成無外乎是RNA和蛋白質，所以其感染過程本質上就是侵入宿主細胞並不斷繁殖的過程。

圖中展現了HIV病毒從感染宿主細胞（CD4細胞）到複製後代的幾個主要環節：

第一步，HIV病毒與宿主細胞相互識別融合，HIV病毒通過受體細胞表面的特異性結合位點成功入侵宿主細胞，並將自己的RNA注入宿主細胞；

第二步，逆轉錄。所謂「逆轉錄」，就是利用RNA生成DNA的過程，由於和DNA到RNA的「轉錄」過程相反，所以被稱為「逆轉錄」。HIV的逆轉錄，就是病毒RNA在逆轉錄酶的作用下將自己逆轉錄成DNA；

第三步，病毒基因整合入宿主細胞。為了能夠利用宿主細胞的轉錄機制「批量生產」自己的後代，逆轉錄後的雙鏈DNA會潛入宿主細胞核，在整合酶的作用下，與宿主細胞的基因組整合，成為宿主細胞的一部分，可以說很6了；

第四步，轉錄。已經成功與宿主細胞基因組融合之後，就可以堂而皇之地使用宿主的轉錄機制，利用正常的細胞轉錄出各種病毒RNA以及所需的各種病毒蛋白質了；

第五步，組裝。這些合成好的病毒RNA和病毒蛋白質在宿主細胞內毫不見外地組裝成熟，形成病毒顆粒雛形。

第六步，修飾與成熟。後代病毒顆粒雛形進行最後的修飾，在蛋白酶的作用下將病毒蛋白進行修飾，形成最終具有感染能力的新一代完成的HIV病毒顆粒。

這六個步驟每一步都至關重要，科研人員研製艾滋藥物的重要靶點就是針對這六個環節。

對應地，目前已上市的抗艾藥物主要類別有：核苷類逆轉錄酶抑製劑、非核苷類逆轉錄酶抑製劑、整合酶抑製劑、蛋白酶抑製劑、CCR5拮抗劑以及融合抑製劑等共六類，常用的抗病毒治療藥物的攻擊環節是第二步病毒的逆轉錄過程，以及最後一步蛋白酶的修飾過程，針對第四、第五步的藥物目前還在研發中。

公眾熟知的所謂「雞尾酒療法」，就是像調雞尾酒一樣把幾種不同作用機制的藥物聯合起來運用，各種藥物多管齊下，在多個環節上作用，提高對病毒複製的抑制作用。而艾博衛泰的作用機制針對的是HIV的第一個環節，即阻止HIV進入宿主細胞。

其作用的位點是病毒外膜的跨膜糖蛋白gp41，通過抑制病毒包膜與受體細胞融合，從而阻斷HIV複製，是一類「膜融合抑製劑」，每周只需給葯一次就能起到效果，可顯著改善HIV感染者用藥的依從性，提高生活質量。

艾博衛泰是多肽類藥物中的一種，作為抗病毒藥物中的一大門類，多肽葯是近年來世界製藥行業的研發熱點。那麼，多肽葯又是什麼呢？

（二） 「多肽葯」到底是什麼葯？

要想知道什麼是「多肽葯」，首先要從這個「肽」字說起。

在高中生物中許多人學過，蛋白質的基本組成單位是氨基酸，氨基酸是羧酸碳原子上的氫原子被氨基取代後的化合物，其中含有氨基和羧基兩個官能團。氨基酸的這兩個官能團通過脫水縮合形成的化學鍵就是「肽鍵」。兩個氨基酸相連形成「二肽」，超過10個就統稱「多肽」，超過50個就稱為「蛋白質」了。每一條肽鏈都會最後剩下自由的α-氨基或α-羧基，也就是多肽合成中提到的N端和C端。

（多肽結構示意）

和更早發展的小分子藥物不同，多肽葯由於本身含有肽鏈，會被消化系統的蛋白酶分解，所以，多肽葯都是注射使用的。同時，由於它本身就是一種「微型蛋白質」，所以具有生物活性高、特異性強、毒性反應弱、在體內不易產生聚集、與其他藥物相互作用比較少、與體內受體親和性高等優點。

多肽葯的注射方式使得其使用起來並不是非常方便。比如，使用艾博衛泰治療的話，注射的方法是靜脈滴注（打吊瓶），每次注射大約45分鐘，患者第1、2、3、8天注射一次，之後每周一次。艾博衛泰進入人體後會和血清白蛋白形成共價結合，其不可逆的結合使得保存抗HIV-1活性的同時，極大降低了導致過敏的可能，在體內的半衰期延長到11天，因此，每周注射一次即可達到療效。

從藥效上看，多肽類藥物在治療腫瘤、糖尿病、心血管疾病、肢端體肥大症、骨質疏鬆症、胃腸道疾病、中樞神經系統疾病、免疫疾病以及抗病毒、抗菌等方面具有顯著的療效。目前多肽類藥物研發項目大多集中在抗癌、糖尿病、抗心力衰竭等領域，據不完全統計，全球還有十幾種多肽葯活躍在臨床Ⅲ期及以後試驗中。

當然，在研製早期，多肽葯會遇到穩定性差，體內易降解，半衰期短等成藥性差的問題，不過近年來隨著微球、脂質體、聚乙二醇(PEG)修飾等方法的開發，多肽葯的研發呈現加速趨勢，並促進了多肽藥物的二次開發利用。

（三）多肽葯合成難在哪兒？

多肽葯的優良療效來自於它本身作為氨基酸和氨基酸衍生物組成的特性，與人體蛋白質上的作用位點有特別的親和性。然而，也正是這一特點，使得多肽葯相比於小分子藥物更難製備。

多肽藥物主要由氨基酸或者氨基酸衍生物組成，可以通過氨基酸逐步連接或者多個肽鏈片段縮合再經過較複雜的純化工藝得到。目前，多肽的製備方法有生物組織提取法、基因重組表達法和化學合成法。其中，化學合成法製備是主要技術，已上市的多肽藥物有90%以上可通過化學合成法製備，化學合成多肽目前又主要包括液相法、固相法、液相固相結合法。

人工合成多肽，其實已經有100多年的歷史了。早在1907年，Fischer成功地採用液相法合成十八肽Leu-(Gly)3-Leu-(Gly)3-Leu-(Gly)9。液相多肽合成的優點是可以節約原料、定量監控反應進度，但是中間體純化操作複雜，合成周期較長，成藥率低。

1963年，Merrifield創立了將多肽C端的氨基酸固定在不溶性樹脂上，然後在樹脂上依次偶聯氨基酸合成多肽的固相合成法(solid-phasepeptidesynthesis，簡稱SPPS)。這種方法操作簡單，通過快速過濾、洗滌等操作可以輕鬆出去中間體和原料，無需中間體純化步驟，提高了產品總收率。同時，這種固相合成法具有便於計算機控制的優點，特別適合自動化生產。正是這項技術，使得多肽葯進入了飛速發展的階段。

具體來說，固相合成法是將氨基酸的C端固定在樹脂上，再通過與目標氨基酸不斷偶聯，經過一系列「縮合」「脫保護」的反覆操作，實現肽鏈的合成。

為了確保N端氨基酸完成反應，通常使用「臨時性」保護基保護N-α氨基，如果氨基酸的側鏈也有反應活性，則需要使用「半永久性」保護基保護起來。待反應結束後再用催化劑除去。同時將肽鏈從樹脂上裂解下來。

按照氨基酸保護策略，固相多肽合成法可分為Boc(叔丁氧羰基)合成法和Fmoc(9-芴甲氧羰基)合成法。

對於特定長肽序列還可以採用固相液相結合法進行。序列超過50個氨基酸的長肽合成，若採用氨基酸逐步偶聯的固相法製備，隨著氨基酸數量的增多，空間位阻等因素會使反應難度加大，具有一定的局限性。這時就會先使用固相法合成多個短肽片段，再使用液相法將短肽片段逐一接連起來。

多肽葯都是具有獨特氨基酸序列的多肽，所以也可以存在多條合成路線，每條路線都有自己的特點，在充分調研，掌握藥物特性後，可以通過工藝摸索選擇最適合特定產品的工藝路線。

（四）合成後的藥物離投入市場還有多遠？

通過臨床試驗確定了藥物的成分和結構之後，進入市場大批量生產，則成為了製藥過程的另一大問題，工藝研究是制約藥物療效和藥品價格的一大因素。

多肽藥物工藝研究和優化過程與小分子藥物差異較大。多肽類藥物如果對每個氨基酸偶聯反應步驟所涉及的反應溶劑、催化劑、反應時間、反應溫度等條件進行逐一摸索的話，會造成工作量巨大且沒有可操作性的問題。因此，實際中往往需要結合多肽葯的組成氨基酸的特點進行針對性考察。

比如組氨酸(His)、半胱氨酸(Cys)、苯丙氨酸(Phe)等易消旋；天冬醯胺(Asn)、谷氨醯胺(Gln)等易水解；蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、組氨酸(His)、色氨酸(Trp)等易氧化；天冬氨酸(Asp)，尤其是天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)和天冬氨酸-甘氨酸(Asp-Gly)肽鍵參與形成的肽鏈較易斷裂等。

只有分析並考察多肽藥物在合成過程中保護氨基酸的活化和偶聯、脫保護、肽鏈裂解、修飾(二硫鍵鏈接)、多級純化、酸根轉型、濃縮、冷凍乾燥等各操作單元中可能產生的雜質，才能建立相應控制策略，減少雜質的產生。

在起始物料控制方面，由於各種氨基酸是構成終產品的結構片段，因此其質量直接影響成品的質量。

氨基酸的中心C原子具有「手性」，構成多肽藥物的氨基酸絕大多數含有手性中心，對映異構體雜質引入肽鏈後，會形成結構、性質與目標產物相似的差向肽雜質，提純難度較大。

多肽合成中，各種保護氨基酸作為構成終產品的結構片段，其質量情況直接影響終產品的質量，應定義為關鍵起始物料，並建立嚴格的質控標準。對於保護氨基酸企業制定的內控標準中，除常規的性狀、比旋度、純度項目以外，還應該開展雜質譜研究。

目前，多肽藥物的製備主流方法為固相合成Fmoc保護法。多肽葯合成的工藝研究和優化過程能反映出對工藝的理解和掌控程度。

在工藝考察過程中需要對以下內容進行考察，最大限度的降低雜質的生成。

1.氨基酸偶聯過程：由於固相法合成多肽中，肽鏈未與樹脂裂解，缺少有效的中控手段，因此工藝過程參數探索顯得十分重要，特別是對於中間體的檢測，可以反映出不容易控制的質控點，通過優化工藝降低提純難度，優化產率。

2.裂解條件的選擇：完成全保護肽序列的合成之後，需要通過酸解作用將側鏈「半永久性」保護基除去，同時將肽鏈從樹脂上裂解下來。由於酸解過程中會產生三苯基甲基、叔丁基等碳正離子，因此也需要清除劑來捕捉碳正離子來保護氨基酸側鏈不發生反應。

3.肽鏈的修飾：部分多肽藥物在合成氨基酸序列之後還需要進一步結構修飾，才能得到目標產物。

4.純化：由於反應過程中產生了缺失肽、錯結肽、差向肽等雜質，需要對成品進行提純。多肽藥物合成一般需採用多種不同原理的HPLC提純方法進行精製。

5.富集：多肽葯的最終產品一般採用凍干手段製備，部分多肽葯對熱敏感，具有熱不穩定性，在凍干工藝時要考慮合理的凍干條件。

只有經過了這5個環節的嚴格把控，才能最終得到合格的多肽葯，走下生產線進入市場。

結語

抗艾新葯艾可寧歷經長達16年研發、150多項研究，是多肽葯研製的一個縮影。如今走向市場之後，藥品生產能否保障穩定質量，最終到達患者手中能否用得起，似乎還需要時間給出答案。但是有一點是毋庸置疑的，在中國，這樣的藥物研發還需要更多的企業投身其中。

本文由了不起的中國製造欄目獨家出品

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