CRISPR編輯技術面臨新的安全隱患

【編者按】CRISPR–Cas9技術將來在臨床上的應用面臨最大的顧慮是Cas9的脫靶率。5月30日，Nature Methods發表的一篇文章聲稱「CRISPR-Cas9技術可引發基因組上發生數百個意想不到的的基因突變」（【聚焦】CRISPR可致數百個位點突變，引入基因治療需謹慎），引起軒然大波，不過該論文在今年3月份被撤稿（爭議熱門論文遭撤稿丨特別關注）。然後今年5月份，Genentech公司的研究團隊在Nature Methods雜誌上發表文章，詳細分析了編輯的小鼠和大鼠身上的脫靶位點（重審CRISPR的脫靶效應，Nature Methods發文全面分析基因編輯鼠的脫靶位點）。事實上，CRISPR–Cas9技術除了面臨脫靶問題，另一個面臨的深層次問題是還可能在作用靶點附近導致大規模的DNA刪除，在部分情況下，甚至引起複雜的DNA重排，研究人員發現在小鼠幹細胞和人類視網膜色素上皮細胞內，可能出現規模達數千DNA鹼基的刪除，導致臨近基因或調控序列可能受到影響，並改變細胞功能，因此引起的DNA重排問題也成為了CRISPR–Cas9技術面臨的另一個安全隱患，相關工作17日在線發表在Nature Biotechnology雜誌上。為了使讀者更好的了解該工作，BioArt特別邀請了對相關領域有過深入研究的北京大學胡家志研究員對該工作進行點評分析，以饗讀者！

責編 迦 漵

點評 胡家志（北京大學）

來源 BioArt

CRISPR/Cas9在基因治療方面展現出巨大的潛力，其主要通過在預定位點上產生DNA雙鏈斷裂來啟動基因的改造或替換。作為高表達量的外源性酶，Cas9在哺乳動物細胞內並無共演化形成的嚴密調控系統，幾乎註定它會成為一匹脫韁野馬，在基因組上造成預計外的損傷。不久前Warming團隊及合作者在Nature Methods上撰文，在單細胞水平上對Cas9的脫靶活性進行了描述【1】（重審CRISPR的脫靶效應，Nature Methods發文全面分析基因編輯鼠的脫靶位點）。

Bradley及其同事剛剛在線發表的這篇Nature Biotechnology文章進一步探討了CRISPR/Cas9在目的編輯位點附近所造成的大片段缺失及其它複雜的重組【2】。他們所呈現的最新結果並不讓人意外，這些數據表明CRISPR/Cas9造成的DNA雙鏈斷裂與其它機制產生的DNA雙鏈斷裂並無明顯不同，儘管有報道表明Cas9在切開DNA後會在斷裂末端上停留【3】，可能會影響下一步的修復過程。

DNA雙鏈斷裂的修復需經歷四個步驟──識別、加工（如必要）、連接及末端拴綁。DNA雙鏈斷裂發生後，以ATM激酶為首的DNA修復通路會識別損傷並啟動修復【4】。

首先，一部分DNA雙鏈斷裂會被末端直連修復（非精準修復），其中一些會造成損傷位點附近的突變；在基因編輯領域，我們稱之為序列增刪 (indels)，這也是經常被用來衡量CRISPR/Cas9切割效率的標誌。其次，會有一部分斷裂的末端未能直連修復，則會被一些酶加工/切除，如果這部份被加工的末端隨後被末端連接修復，則會造成片段缺失；這一可控步驟在DNA修復領域被稱為強切除 (Extensive resection)，集中在斷裂的±3 kb左右【5】，所以Bradley及其同事在Cas9切割位點附近5500 bp的區域內發現了大量的片段缺失 。這部份加工後的末端也可能被精準修復，即同源末端重組，修復後的產物在Bradley及其同事的檢測方法中不可見。再次，有很少一部分DNA末端的加工能延長至100 kb甚至更遠的範圍，被稱為長程切除 (Long resection)，其被末端連接修復會造成大片段缺失【5-7】，其中部分跟也被Bradley及其同事發現。最後，DNA斷裂的兩個末端可能失去拴綁的紐帶，各自與基因組上的其它損傷末端連接形成染色體易位等更複雜結構【5,8】，這部份被Bradly及其同事預測到。

關於CRISPR/Cas9造成的各種染色體異常結構，筆者及同事在2015年發表在Nature Biotechnology的論文中利用開發的高通量CRISPR/Cas9脫靶活性檢測方法 (LAM-HTGTS) 也鑒定過並有系統的描述，包括片段缺失、插入、倒置、染色體易位、雙著絲粒染色體等【5】。Bradley他們及我們的工作表明，對CRISPR/Cas9脫靶活性的關注，不僅僅要關注具有相似序列的脫靶位點上，還應涉及到其它各種染色體異常結構。

目前看來，CRISPR/Cas9造成的基因組DNA雙鏈斷裂可能給細胞群帶來一些染色體異常結構，因此其並不能直接運用於人體。但筆者覺得眼前至少有兩種方案可能有助於規避這種異常：一是從CRISPR/Cas9處理過的細胞群中通過篩選的方法篩到不含有異常結構的細胞並進行擴大培養，但須防止篩選到p53抑癌基因缺失的細胞【9,10】；二是單鹼基修飾酶 (Base editor)，其作用不依賴於DNA雙鏈斷裂，但其脫靶活性仍待進一步鑒定。

參考文獻：

1.K. R. Anderson et al., CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice.Nat Methods, (2018).

2. Michael Kosicki et al., Repair of CRISPR–Cas9-induced double-stranded breaks leads to large deletions and complex rearrangements.Nat Biotechnol, (2018).

3.S. H. Sternberg, S. Redding, M. Jinek, E. C. Greene, J. A. Doudna, DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.Nature507, 62-67 (2014).

4.Frock RL, Hu J, Alt FW. Mechanisms of recurrent chromosomal translocations. In book: Chromosomal translocations and genome rearrangements in Cancer. Springer International Publishing, ISBN: 978-3-319-19983-2.

5.R. L. Frock et al., Genome-wide detection of DNA double-stranded breaks induced by engineered nucleases.Nat Biotechnol33, 179-186 (2015).

6.R. Chiarle et al., Genome-wide translocation sequencing reveals mechanisms of chromosome breaks and rearrangements in B cells.Cell147, 107-119 (2011).

7.I. A. Klein et al., Translocation-capture sequencing reveals the extent and nature of chromosomal rearrangements in B lymphocytes.Cell147, 95-106 (2011).

8.J. Hu et al., Detecting DNA double-stranded breaks in mammalian genomes by linear amplification-mediated high-throughput genome-wide translocation sequencing.Nat Protoc11, 853-871 (2016).

9.E. Haapaniemi, S. Botla, J. Persson, B. Schmierer, J. Taipale, CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response.Nat Med,(2018).

10. R. J. Ihry et al., p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells.Nat Med24, 939-946 (2018).

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