實時分析、周期縮短、超長讀長！這款手持式測序儀在快速檢測領域「魅力十足」

生物探索

編者按

病原體傳播，無論是經過空氣、食物或是水，都有可能對畜牧業、農業和人類健康造成深遠的影響。然而，當前的測序技術對微生物分析仍存在很大挑戰。如今，利用納米孔測序的實時性和直接DNA/RNA的能力，科學家們已經將Oxford Nanopore公司研發的MinION運用在了微生物鑒定、抗生素抗藥性分析以及結核樣本檢測等需要快速檢測結果的領域，大大縮短了從取樣到出結果的周期。

現代測序技術的出現能夠對已培養的、更重要的是對未培養的微生物進行高通量基因組分析，大幅提高了鑒定和表徵微生物的能力。然而，當前的測序技術對微生物分析仍存在幾大挑戰。例如，研究樣品可能在實驗室以外，或者研究環境位置偏遠。傳統龐大笨重的測序儀器不易裝運，同時需要大量的IT基礎設施和專業人員操作，使得這些技術難以用在偏遠地區或移動環境中進行實地分析。在監測疾病爆發或在危及生命的感染性疾病中，需要快速獲得準確的基因組信息來鑒定病原微生物，而大多數下一代測序（NGS）的儀器需要經過培訓的工程師精確校準，因此難以用於快速部署。

由Oxford Nanopore公司研發的納米孔長讀長實時測序儀MinION，重量不足100g，體積小到可以放在口袋裡。MinION利用筆記本電腦上的USB介面通電，支持實時鹼基識別和分析，是一種適用於實地研究的獨一無二的攜帶型設備。最近Oxford Nanopore還推出了MinIT測序分析儀，可以和MinION配套使用。MinIT有預先配置的MinION控制軟體(MinKNOW)，可進行數據捕獲和鹼基識別。無需為MinION測序配備單獨的筆記本電腦。

01

周期縮短

猩紅熱病原體

最近，中國疾控中心傳染病預防控制所、傳染病預防控制國家重點實驗室張建中研究員課題組針對當前我國流行的重要細菌性傳染病-——猩紅熱的病原體A族鏈球菌（Group A streptococcus, GAS）[1]，利用Oxford Nanopore技術進行基因組完成圖的測定。

課題組提取了自猩紅熱高發區分離的GAS菌株TJ11-001的基因組，利用納米孔MinION測序儀在R9.4測序晶元上進行了測序。結果顯示，Oxford Nanopore測序技術在10分鐘內產生的reads數據即可即時獲取GAS基因組中全部重要的耐葯基因（紅霉素耐葯基因ermB、四環素耐葯基因tetM等）、毒力基因（紅疹毒素speC、鏈球菌超抗原ssa等），並確定了該菌株為emm12基因型。

單獨用Oxford Nanopore的長reads在1小時內即可組裝達到GAS基因組平均長度（1.85Mb），準確率達到99%以上。同時可獲得包括長度為61kb的ICE-HKU937和長度為46kb的prophage HKU.vir等在內的全部移動元件序列信息，這些移動元件往往攜帶上述多種耐葯基因和毒力基因在GAS不同血清型菌株間播散，可能是引起猩紅熱發病率上升的重要因素，對這些大片段基因組移動元件的監測對於我國乃至全球猩紅熱防控具有重要意義。

腸道病毒

腸道病毒（EV）是一種單鏈RNA病毒，每年可造成全球數百萬人感染。感染引起的臨床癥狀可從良性咽喉痛到更為嚴重的支氣管炎和肺炎。PCR檢測是常規鑒定具有臨床價值的病毒最常用的方法。然而，在使用PCR時，病毒基因組中經常出現的點突變和重組事件有可能導致出現假陰性結果。

瑞士伯爾尼大學的Alban Ramette博士及其小組評估了使用納米孔cDNA和直接RNA測序是否能從臨床研究樣本中獲取完整的腸道病毒基因組[2]。使用來自培養的病毒cDNA樣本，他們在測序運行開始的幾分鐘內就獲得98.8％的序列一致性準確度。在使用nanopolish軟體對序列進行處理後，精確度能提高到99.8％。此外，在像病原體鑒定這類時間要求嚴格的應用中，伯爾尼大學使用的無需逆轉錄或擴增的RNA直接測序樣本製備法只耗時5.5個小時，相比cDNA方法需23個小時。

腸道微生物組是一個富含抗微生物藥物耐藥性基因的環境，對抗生素治療反應呈顯著影響。腸道耐藥性基因組在確定抗生素治療對共生菌影響方面也有著重要作用。然而，目前尚缺乏快速腸道耐葯基因組圖譜分析的有效方案。藉助納米孔測序技術，丹麥科學家Helm所在的研究小組進行了快速全面的抗生素抗藥性分析。他們使用ICU患者的排泄物樣品進行宏基因組DNA制庫，並在測序6-48小時後鑒定出26個抗微生物藥物耐藥性相關基因，平均序列同源性為97.3％[3]。

結核分枝桿菌

對於結核分枝桿菌（TB）的鑒定，當前廣泛使用的方法建立於實驗室細菌培養基礎上，常常需要耗時數周。在不經培養的情況下，使用PCR進行TB抗微生物藥物耐藥性分析僅可檢測出最常見的耐藥性相關突變。利用納米孔技術，Votintseva等人進行了全基因組測序[4]。

該團隊對培養的牛型結核分枝桿菌BCG菌株(BCG)，以及聯合培養的陰性痰DNA和BCG DNA樣品進行了研究。研究結果表明，在BCG鑒定和吡嗪醯胺耐藥性檢測中，從患者採樣到獲得結果所用時間為7.5小時。而從採樣到得到結果的13.5小時內，可進行準確、全面的抗微生物藥物耐藥性分析。

埃博拉病毒

科學家們還嘗試利用MinION的便攜性進行實地檢測和分析。來自英國伯明翰大學的科學家Josh Quick將MinION通過標準的航空行李帶到了幾內亞，監控在西非流行的埃博拉病毒。在那之前，由於缺乏本地的測序能力，以及無法把樣品到遠距離的測序中心，基因組監測一直處於零星狀態。

Josh Quick的研究小組在到達後的兩天內便將MinION用於實時基因組檢測，證明了它在條件有限的地區也有可能實現病毒病原體實地檢測和分析 [5]。在總共六個月的時間裡，小組共分析了142個埃博拉病毒樣品，鑒定出了獅子山和幾內亞之間的物種傳播，並提供了可用的公共衛生數據。在關鍵資源（包括可靠的電力供應、實驗室、伺服器計算能力）通常嚴重受限的發展中國家，納米孔測序技術有潛力從根本上改變臨床和公共衛生環境中的傳染病診斷。

02

超長讀長

除了實地檢測和實時分析，要真正理解微生物和病原體的多樣性，當務之急還在於建立完整和充分表徵的基因組。微生物基因組中存在重複區域和結構變異，它們對微生物的功能，如抗藥性和毒力因子的發展和傳播往往有著重要的作用。傳統測序技術只能讀取長度為150-300bp的短讀長片段，致使基因組的組裝通常都高度片段化，因而在解析大型結構變異，準確分析重複性基因組或進行相關物種基因組組裝方面面臨巨大的挑戰。

與通常處理短DNA片段的傳統測序平台相比，Oxford Nanopore研發的納米孔測序技術可處理的DNA片段的長度只受限於通過納米孔的DNA的長度。納米孔測序現在已經能夠做到常規處理數十萬鹼基的完整片段，並已經產生了超過2.3Mb的超長讀長[6]。使用超長納米孔讀長，已經可以在單一讀長中對整個病毒基因組進行測序，完全無需組裝[2]。超長讀長的優勢還在於它可能跨越重複DNA和結構變異的整個區域，從而允許更完整、無空白的基因組組裝。這就好比組裝拼圖：拼圖的圖片越大，拼起來就越容易。

除了攜帶型的MinION測序儀，Oxford Nanopore還推出了兩款高通量台式測序儀GridIONX5和PromethION。這兩款測序設備採用與MinION一樣的核心技術，可以分別支持5到48個晶元的運行。每個晶元可以獨立使用，根據實驗需要選擇使用的數量。

03

小福利

目前Oxford Nanopore正向廣大的科研工作者們徵集研究妙想的活動，並已經進入了公眾投票的階段，最終得票最高的5個科研妙想可以分別獲得一個MinION測序儀啟動套裝和一個入門培訓的名額。趕快點擊「閱讀原文」為你心中的最佳妙想投票，幫他們帶走測序儀大獎吧！

End

參考資料：1）You Y, Davies MR, Protani M, McIntyreL, Walker MJ, Zhang J. Scarlet Fever Epidemic in China Caused by Streptococcuspyogenes Serotype M12: Epidemiologic and Molecular Analysis. EBioMedicine. 2018Feb;28:128-135.doi: 10.1016/j.ebiom.2018.01.010. Epub 2018 Jan 11.

2）Ramette, A. Applications of nanopore sequencing to wholegenome sequencing of human viruses in the clinical setting. [online] Availableat: <www.vimeo. com/252171562>

3）van der Helm, E. et al. Rapid resistome mapping usingnanopore sequencing. Nucleic Acids Res, doi:10.1093/nar/ gkw1328 (2017).

4）Votintseva, A. A. et al. Same-day diagnostic andsurveillance data for tuberculosis via whole genome sequencing of directrespiratory samples. J Clin Microbiol, doi:10.1128/JCM.02483- 16 (2017).

5）Quick, J. et al. Real-time, portable genome sequencingfor Ebola surveillance. Nature 530, 228–232, doi:10.1038/ nature16996 (2016).

6）Payne.A (2018) Whalewatching with BulkVis: A graphical viewer for Oxford Nanopore bulk fast5 files.doi:https://doi.org/10.1101/312256

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