Nat Biotechnol：CRISPR/Cas9竟導致大片段DNA缺失和重排

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在幾天前的一項研究中，來自美國伊利諾伊大學芝加哥分校的研究人員發現在利用CRISPR/Cas9進行基因編輯遭遇失敗（大約在15％的時間發生）時，這通常是由於Cas9蛋白持續地結合到DNA上，這會阻止DNA修復酶進入切割位點（詳情參見生物新聞報道：Mol Cell：揭示CRISPR/Cas9基因編輯為何有時會遭遇失敗）。

科學家們已將CRISPR基因編輯作為一種改變基因組的方法，但有些人提醒道，不想要的DNA變化可能因未檢測到而被遺漏。

針對人胚胎幹細胞的基因編輯實驗揭示出CRISPR-Cas9系統的不精確性。圖片來自Annie Cavanagh via Wellcome/CC BY NC。

根據一項新的研究，這種基因編輯工具能夠導致基因組上的靶位點附近發生大片段DNA缺失和重排。這些變化能夠干擾對實驗結果的解釋，並且可能使得設計基於CRISPR的療法的努力複雜化。相關研究結果於2018年7月17日在線發表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為「Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements」。

這一發現不僅與CRISPR而且也與其他的基因編輯系統的之前結果相一致（Nature Communications, 2017, doi:10.1038/ncomms15464）。美國沙克生物研究所生物工程師Patrick Hsu說，這些不想要的編輯是一個值得更多關注的問題。他指出，「我確實認為這一點在這個領域一直被低估。」

CRISPR-Cas9基因編輯依賴於Cas9酶在特定的靶位點上切割DNA。細胞隨後嘗試利用DNA修復機制重新密封這種DNA斷裂。這些機制並不總是完美地起作用，有時DNA片段會被刪除或重排，或者不相關的DNA片段被整合到染色體中。

領導這項新研究的英國韋爾科姆基金會桑格研究所小鼠遺傳學家Allan Bradley說，「細胞會嘗試將DNA重新拼接在一起。但是，它並不知道哪些DNA片段彼此相鄰。」

人們經常利用CRISPR產生小片段DNA缺失，希望這樣能夠破壞一個基因的功能。但是在檢查CRISPR編輯時，Bradley和他的同事們發現了大片段DNA---通常長數千個鹼基---的缺失和複雜的DNA序列重排，這些重排導致之前相隔遙遠的DNA序列被拼接在一起。這種現象在他們測試的所有三種細胞類型---小鼠胚胎幹細胞、小鼠造血祖細胞和一種人分化細胞系---中都很普遍。

質量控制

許多人使用一種擴增短片段DNA的方法來測試他們的編輯是否已經完成。但是美國布蘭戴斯大學分子生物學家James Haber說，這種方法可能會錯過更大的DNA片段缺失和重排。

Hsu指出，這些缺失和重排應當僅在依賴於DNA切割的基因編輯技術中發生，而在避免切割DNA的其他類型的CRISPR改進版本中不會發生。比如，一種被稱作鹼基編輯的方法使用一種改進的CRISPR系統在不切割DNA的情形下將一個DNA鹼基轉換為另一個鹼基（Nature, doi:10.1038/nature.2016.19773）。其他的系統使用與其他的酶融合在一起的滅活Cas9來打開或關閉基因，或者靶向RNA（Nature, doi:10.1038/531156a）。

一些科學家已經在尋找更大的DNA片段缺失。位於美國馬薩諸塞州劍橋市的eGenesis公司正在利用基因編輯對豬器官進行基因改造以便用於移植。該公司聯合創始人兼首席科學官Luhan Yang說，這家公司的科學家們經常利用多種方法來尋找大片段DNA和小片段DNA缺失。 同樣地，在另一家致力於開發基於CRISPR的療法的公司Intellia那裡，科學家們在小鼠肝臟基因編輯研究中一直在尋找大片段DNA缺失。Intellia公司高級副總裁Thomas Barnes說，到目前為止，他們沒有發現任何大片段DNA缺失的證據。他說，這可能是因為他的團隊研究的細胞不經常發生分裂。相比之下，Bradley及其同事們開展這項新的研究使用了活躍地發生分裂的細胞。

Haber說，總體而言，這些不想要的編輯是一個值得更多關注的問題，但這不應該阻止任何人使用CRISPR。他說，「這意味著當人們使用它時，他們需要開展更加充分的分析。了解您的突變是否與您認為的一樣，這一點是非常重要的。」

原始出處：

CRISPR gene editing produces unwanted DNA deletions

Michael Kosicki, K?rt Tomberg & Allan Bradley. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology, Published online: 16 July 2018, 10.1038/nbt.4192.

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