全球9個實驗室聯合開展小RNA測序方案的綜合評估

RNA測序越來越多的應用於不同樣本類型的定量分析，如離體細胞、組織和液態活檢中的microRNA、piRNA和snoRNA等。這些小RNA片段在癌症等疾病狀態下會發生改變，可作為生物標誌物幫助人們在早期階段檢測疾病。但由於存在多種RNA測序方案，不同實驗室採用不同方案檢測小RNA，會得到不同的結果。而且目前使用的小型RNA測序文庫製備方法的準確性和重現性並沒有得到系統的測試。

2018年7月17日，美國國立衛生研究院細胞外RNA通信聯盟研究人員在Nature Biotechnology上發表了RNA測序的最新研究成果，來自該聯盟9個實驗室的研究人員評估了3種不同的小RNA測序商業試劑盒，以及Pacific Northwest研究所David Galas實驗室開發的內部方法和該方法的不同改進方案。研究發現，用於小RNA測序的隨機序列接頭文庫製備試劑盒，可能比固定序列接頭常規文庫製備試劑盒的檢測偏差小。並且將固定序列與隨機序列接頭的文庫構建方法結合，可以降低這種檢測偏差。

由於分子尺寸差異較大，所以在同一樣本中，用於檢測mRNA的試劑盒不能用於小RNA測序。通常為了使小RNA更長，RNA分子末端添加接頭，目前的小RNA文庫製備方法主要分為兩種類型：一種是添加已知固定序列接頭，一種是添加隨機序列接頭。

該研究報道了9個不同實驗室的聯合檢測結果，這些實驗室都有各自獨立的序列參考。試驗中，各實驗室分別檢測了合成小RNA和人血漿衍生RNA樣本，評估了3種採用固定序列接頭的商業化文庫製備方案，包括Illumina TruSeq，New England Biolabs NEBNext和TriLink Biotech CleanTag，以及6種實驗室開發的隨機序列接頭方案及改進方案，包括PerkinElmer開發的Bioo Scientific NextFlex，2015年東英吉利大學研究人員開發的建庫方案，Galas開發的內部方案等，其中Galas開發的方案也被稱為4N方法。

試驗流程設計

該研究的主要作者，密歇根大學Muneesh Tewari實驗室Maria Giraldez博士表示，她的研究小組對利用RNA測序方法分析血液中的癌症生物標誌物非常感興趣。該研究項目的主要目的是從血液中分析RNA，為疾病早篩提供依據。因為與組織、細胞的樣本不同，血液、尿液中RNA含量很小，研究團隊對RNA測序也不甚了解，所以該團隊決定先分析各種RNA測序方案，以便確定它們在血液和其他生物液體小RNA測序中應用效果。

研究團隊共對377個小RNA文庫進行了測序，還對由兩組已知合成RNA組成的對照文庫以及人血漿衍生RNA文庫進行了測序。研究發現，不同測序方案對特異序列的存在識別偏差。在合成RNA文庫的測序中，不同測序方案對16-25個核苷酸小RNA的回收率不同，並且觀察到的偏差大於已知長RNA測序中存在的偏差。

儘管所有的檢測方案都有一定的偏差，但Galas開發的4N方案偏差相對較小。因為在使用隨機序列接頭時，每個RNA分子都能獲得相同的結合機會，能更好的反應樣本內容。相比之下，固定序列接頭會偏好結合某些序列，而對其他序列「不理睬」。如果某種含量很低的microRNA不被接頭支持，最終構建的文庫很可能就會漏掉這部分信息。例如，研究人員計算了讀取序列的中位百分比，發現這些序列的讀取比預期高10倍或者低10倍，使用固定序列接頭的TruSeq、CleanTag和NEBNext方案的中位百分比在42％至62％之間，而4N方案則在3％至22％。

但在實際應用中，使用固定序列接頭的商業試劑盒比4N方案應用更方便，屬於用戶友好型產品。而4N方案顯得更繁瑣乏味，這也是今後的研究設計需要考慮的問題。

PerkinElmer的NGS產品組合主管Arvind Kothandaraman表示，在售的隨機序列接頭小RNA試劑盒PerkinElmer，也針對PerkinElmer的Sciclone G3進行了自動化設計，提高了工作流程效率，並減少了變異性。他指出，該研究證明了減少文庫製備過程中引入的小RNA測序偏倚的重要性。

目前Illumina和NEB的Biolabs尚未對該研究發表評論。

此外，研究人員發現對於相同的樣本，只要嚴格按照操作程序進行，在同一實驗室內部和不同實驗室之間的重複試驗中偏差一致。在評估各個標誌物的丰度時，不同的文庫製備方法產生了不同的結果，且測序方案造成的結果偏差可能大於實驗室之間的差異。他們還證明，將固定序列與隨機序列接頭的文庫構建方法結合，可以降低這種偏差。而且使用小RNA測序對樣本中的微小RNA進行相對定量，在實驗室和方法上是準確可重複的。

接下來，研究團隊將對真實樣本進行miRNA測序，將癌症與健康對照樣本進行比較，尋找miRNA和血液中的其他循環小RNA。他們表示最有可能使用4N方案。

研究人員表示，無論使用哪種測序方案，都需要標準化。如果各個實驗室都採用相同的實驗方案，確保「每個小細節」都相同，那麼結果變化不大，這樣檢測結果才能相互比較，也希望該研究成果能夠為後續相關研究提供參考。

參考文獻

1. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling

2. Michigan Team Characterizes Biases in Small-RNA Sequencing Techniques

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