蛋白質組學與疾病生物標記物的篩選鑒定
生物標誌物（Biomarker）是指可供客觀測定和評價的一個普通生理或病理或治療過程中的某種特徵性的生化指標，通過對它的測定可以獲知機體當前所處的生物學過程中的進程。檢查一種疾病特異性的生物標誌物，對於疾病的鑒定、早期診斷及預防、治療過程中的監控可能起到幫助作用。尋找和發現有價值的生物標誌物已經成為目前研究的一個重要熱點。
蛋白質是執行生物學功能的活性生物大分子，和傳統方法相比，蛋白質組學能夠更直接地鑒定到病人和正常人之間差異表達的蛋白，成為發現生物標誌物的重要途徑。
從CNS等學術期刊中，我們也發現越來越多的蛋白質組學研究人員開始採用高通量技術不斷發現疾病生物標誌物，為此，我們在「行業精選」板塊下新增了「標記物篩選」專題，也整理了部分典型的運用案例，以饗讀者。
案例一：臨床唾液樣本中篩選牙周病的生物標誌物
案例二：血清外泌體中篩選膽管癌生物標誌物篩選
案例三：血清樣本中篩選慢性移植物抗宿主病生物標記物
案例四：磷酸化組學揭示黑色素瘤生物標誌物
案例五：蛋白質組學篩選神經退行性疾病蛋白標誌物
案例六：瀰漫型胃癌的分子分型與生物標誌物篩選
案例1：蛋白質組學篩選牙周病的生物標誌物
牙周病是指發生於牙齒周圍組織的疾病，是常見的口腔疾病。本病在早期多無自覺癥狀，且缺乏有效的分子診斷手段，因此該病的早期診斷仍然具有挑戰性。唾液是一種無創性臨床樣本，包含有價值的臨床相關生物標記物，如果有效利用可以促進早期疾病的診斷和監測。
研究對象：67例 臨床唾液樣本
疾病：牙周病（慢性牙周炎CP，侵襲性牙周炎AP，牙齦炎G）
期刊：Molecular & Cellular Proteomics
影響因子：6.540
技術路線
研究結果
研究者通過label-free定量蛋白組學分析，對67例臨床唾液樣本，包括17例慢性牙周炎(CP)患者唾液，17例侵襲性牙周炎(AP)患者唾液，17例牙齦炎(G)患者唾液以及16例健康人(H)唾液進行研究分析。結果共鑒定到486個蛋白，運用富集分析等技術，挑選富集程度排名前十的通路蛋白作為候選標誌物。
隨後研究者利用蛋白質靶向定量技術，對82例臨床樣本，其中AP (n=21)，CP (n=21)，G (n=20)，H (n=20)進行了靶向驗證。最終成功在75例唾液樣本中定量到60個蛋白，定量成功率達92%。對差異蛋白進行ROC曲線及曲線下面積(AUC)統計分析，篩選得到12個標誌物蛋白對牙周疾病具有很好的指示作用。
圖1潛在標誌物蛋白的協同係數與使用頻率分析
案例2：血清外泌體中篩選膽管癌蛋白生物標誌物
膽管癌（CCA）是惡性度較高的消化系統腫瘤。因其發展隱蔽且臨床癥狀及體征出現晚，故給早期診斷帶來困難。原發性硬化性膽管炎（PSC）是導致膽管癌的主要原因之一。在非侵染時期，鑒定肝內的膽管癌及肝癌（HCC）是非常困難的。目前尚未有準確區分CCA，PSC，及HCC的生物標記物。
研究對象：134例 臨床血清樣本
疾病：膽管癌，膽管炎，肝癌
期刊：Hepatology
影響因子：13.246
技術路線
研究結果
研究者選擇43例膽管癌，30例膽管炎，29例肝癌患者與32例正常人的血清樣本，運用蛋白質組學分析鑒定樣本外泌體中的差異表達蛋白，分析發現膽管癌中VNN1, CRP, FIBG, IGHA1, A1AG1 and GGT1 這6個蛋白的表達量顯著高於其他的三個樣本，其中CRP蛋白顯示出較高的診斷價值。
隨後，研究者異種移植CCA，通過蛋白質組學分析小鼠血液外泌體，從中鑒定到23個人類的蛋白，證明腫瘤的外泌體可以分泌到血液中。說明血清EV中發現的CRP蛋白等新型標誌物蛋白質，具有作為診斷工具的潛在應用價值。
圖2 膽管癌蛋白生物標誌物篩選
案例3：血清樣本中篩選慢性移植物抗宿主病生物標記物
慢性移植物抗宿主病（cGVHD）是在同種異體的造血細胞移植（allo-HCT）後出現的主要併發症，發生率占移植病人的30-50%，同時它也是造成術後存活2年以上病人非複發死亡(NRM)的主要原因。cGVHD受多種因素影響，導致管控變得複雜和困難，加上缺少有效的標誌物，阻礙其及時診斷。
研究對象：6例 小鼠血清樣本，226例患者血清樣本
疾病：慢性移植物抗宿主病（cGVHD）
期刊：Blood
影響因子：15.132
研究結果
研究人員利用TMT標記定量蛋白質組學分析，在同系cGVHD小鼠血清中鑒定和定量到1046個蛋白，其中具有1.2倍以上差異的蛋白有56個，其中4個上調的蛋白：RAS、CRKL和CCL8和CCL9可作為潛在的cGVHD生物標誌物。隨後運用抗體中和和供體蛋白敲除實驗，證明供體T細胞中CRK/CRKL蛋白對cGVHD的發展與維持起重要作用，表明CCL9（人中同源的為CCL15）可能是一個潛在的cGVHD診斷標誌物。
研究人員通過ELISA標記蛋白質定量技術，檢測了178例患有cGVHD的HCT病人，33例未患cGVHD的HCT病人及15個健康人中CXCL17，CCL15（鼠CCL9同源蛋白）和CRKL的濃度，結果顯示CCL15的濃度在cGVHD病人中顯著升高，證明了CCL15可以作為cGVHD診斷的生物標誌物。
圖3膽管癌蛋白生物標誌物篩選
案例4：磷酸化組學揭示黑色素瘤生物標誌物
黑色素瘤（Melanoma）多由黑色素細胞所形成的痣或黑色素斑發生惡變而來，是最常見的皮膚三大惡性腫瘤之一，也是皮膚腫瘤中惡性程度最高的瘤種，容易出現遠處轉移，因此早期診斷和治療因而顯得尤為重要。以黑素細胞絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）為靶點的BRAF與MKK抑製劑聯合療法，是臨床治療BRAF V600突變轉移性黑色素瘤的有效方法。然而腫瘤治療中的藥物抗性問題依舊是獲得更好臨床效果的一個障礙，開發新的抑製劑，採用多種藥物聯用的療法有望成為臨床治療的有效策略。
研究對象：黑色素瘤細胞
疾病：BRAF V600突變轉移性黑色素瘤
期刊：Molecular & Cellular Proteomics
影響因子：5.232
研究結果：
研究者以WM239A轉移性黑色素瘤細胞為研究對象，運用SILAC定量蛋白質組學技術，分析了其分別在MKK1/2和ERK1/2抑製劑刺激下的磷酸化信號通路的差異變化。結果共鑒定到12805個可定量的磷酸化位點，對應3819個蛋白質，其中8390個位點可在兩到三次重複中被定量，有398個磷酸化位點顯著變化1.8倍以上。
生物信息學分析後發現：MKK1/2與ERK1/2 抑製劑調節的磷酸化反應具有比較高水平的重疊性，僅受一種抑製劑調節的磷酸化反應較少；21個磷酸化位點特異性僅受一種抑製劑的影響；最終找到82個潛在的新型的ERK作用靶標。
圖4 磷酸化組學揭示黑色素瘤生物標誌物
案例5：蛋白質組學篩選神經退行性疾病蛋白標誌物
神經退行性疾病有阿爾茨海默病（AD），路易小體痴呆（DLB）和帕金森疾病痴呆（PDD），關於這類疾病還缺乏有效的生物標誌物。近日在著名學術期刊BRAIN上發表文章，利用蛋白質組學研究腦組織中的突觸蛋白，鑒定一些可能成為疾病診斷的生物標誌物，有助於早期預測和診斷該疾病的發生。
研究對象：32例 大腦前額葉皮層組織
疾病：神經退行性疾病（阿爾茨海默氏病AD，路易小體痴呆DLB，帕金森疾病痴呆PDD）
期刊：BRAIN
影響因子：10.840
研究結果
研究人員選取32例患者的大腦前額葉皮層組織，其中9例阿爾茨海默氏病（AD），7例路易小體痴呆(DLB)，8例帕金森疾病痴呆(PDD)和8例無痴呆疾病(C)作為對照，基於質譜的蛋白組學研究方法共鑒定出了10325個蛋白質，其中851個是突觸蛋白質，並且25個突觸蛋白含量發生顯著變化。認知功能下降率與SNAP47，SYBU，LRFN2，SV2C和GRIA3蛋白密切相關，表明這些特定的突觸蛋白在預測神經退行性疾病中可以作為早期疾病的檢測目標。
圖5 蛋白質組學數據分析
案例6：蛋白質組學篩選瀰漫型胃癌生物標誌物
胃癌的發病率在我國惡性腫瘤中居首位，且世界上近乎一半的胃癌病人都在中國，是一種嚴重危害我國居民健康的常見癌症類型。胃癌中以後大約30%是瀰漫型胃癌，其臨床預後是比較差，且缺乏有效的治療手段。軍事醫學科學院賀福初院士、秦鈞教授，聯合北京大學腫瘤醫院沈琳教授等科學家從蛋白質組的角度將瀰漫性胃癌分為三個與臨床預後相關的亞型，提出了具有臨床對應性的瀰漫型胃癌的分子分型模式，並找出了一些潛在的藥物或免疫治療靶點。
研究對象：84例細胞樣本
疾病：瀰漫型胃癌
期刊：Nature Communication
影響因子：12.353
研究結果
研究人員使用高通量蛋白質組技術，對84對瀰漫性胃癌的樣本進行了深入的蛋白質組分析，共鑒定到11,340種蛋白，其中有2,538個蛋白在癌症和癌旁組織中差異性表達。經過生信分析，發現和癌旁組織相比， EMT轉化、DNA複製、細胞周期調控相關蛋白在腫瘤組織樣本中上調錶達，而一些胃功能性蛋白和胃粘膜標誌性蛋白也在腫瘤組織樣本中出現下調。
隨後研究者根據蛋白質表達的特點將瀰漫型胃癌分成三個亞型——亞型PX1，PX2和PX3。作者發現從蛋白組的角度來看，PX1亞型的主要特點是細胞周期的失控，PX2亞型除了細胞周期失控以外還體現出較強的EMT轉化過程，而PX3亞型中則有很多免疫應答蛋白出現上調。這些分型結果與臨床信息作比較後發現，PX3亞型的患者對應著最差的臨床預後，以及明顯的抗化療現象。
圖6 瀰漫型胃癌的免疫治療靶點蛋白表達量分析
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參考文獻：
[1] Nagihan Bostanci,et al. (2018), Targeted proteomics guided by label-free global proteome analysis in saliva reveal transition signatures from health to periodontal disease.Molecular & Cellular Proteomics.
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[3] Du J,et al. (2018), Murine chronic graft-versus-host disease proteome profiling discovers CCL15 as a novel biomarker in patients.Blood,.
[4] Basken J,et al.(2017) Specificity of phosphorylation responses to MAP kinase pathway inhibitors in melanoma cells.Molecular & Cellular Proteomics.
[5]Erika Bereczk, et al.,2018, Synaptic markers of cognitive decline in
neurodegenerative diseases: a proteomic approach.BRAIN.
[6]Sai, Ge,et al. A proteomic landscape of diffuse-type gastric cancer[J].Nature Communication, 2018.
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