拉曼光譜檢測技術在早期肺癌診斷方面的研究進展

摘要

肺癌是目前世界範圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，5年生存率僅18%，伴有遠處轉移的患者則為5%，而I期非小細胞肺癌患者5年生存率最高達77.9%，因此肺癌的早診早治是改善預後的關鍵。拉曼光譜技術作為一種非侵入性的檢測技術，可實現對癌變組織與正常組織之間分子水平結構差異的檢測，從而可用於肺癌的早期診斷。該文綜述了拉曼光譜檢測技術結合不同組織或體液樣本在早期肺癌診斷方面的研究進展。

肺癌是目前世界範圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，全球年新發肺癌患者約182.5萬人，死亡160萬人[1]，而中國年肺癌新發及死亡人數則分別為約78.1萬和62.6萬[2]。數據顯示肺癌患者5年生存率低至18%，伴有遠處轉移的患者則為5%[3]。究其原因，早期肺癌多無明顯臨床表現，多數患者發現肺癌時已至晚期，錯失最佳治療時機，預後不佳。有研究表明I期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）肺癌患者5年總生存期（overall survival, OS）能達到73.5%-77.9%，5年無病生存（disease-free survival, DFS）率為65.5%-72.7%[4]。因此，早期肺癌診斷對於提高肺癌早治率，降低患者死亡率非常重要。

目前臨床常用早期肺癌診斷方法包括血腫瘤標誌物、胸部X線片、胸部計算機斷層掃描（computed tomography, CT）、纖維支氣管鏡、支氣管超聲引導下針吸活檢術、經皮肺穿刺活檢等，在早期肺癌診斷方面表現出了很好的臨床效用，但或多或少存在敏感度差、準確率低、成本高、周期長、有創等問題。因此研究一種敏感度強、特異性高、無創、簡單有效、成本低的診斷技術等具有重要臨床意義。拉曼光譜檢測技術作為一種非侵入性微量物質檢測技術，具有靈敏度高、特異度好、快速有效等優點，在癌症診斷方面表現出了良好的臨床應用前景。本文通過複習文獻，對拉曼光譜檢測技術在肺癌診斷方面的應用發展作一綜述。

1 拉曼光譜檢測技術的原理

拉曼光譜最早於1928年由印度物理學家Raman等[5]發現，是研究分子振動的一種光譜學方法，它可以實現分子化學物質的指紋識別，從而實現生物分子的無損檢測。在癌症檢測方面，拉曼光譜可以探測到與癌變相關的微小分子層次變化，如核質比增加、染色質無序、高代謝活性、脂質和蛋白質分子水平變化等，通過對比研究癌組織和正常組織的拉曼光譜，可發現其能反映組織病變信息的特徵光譜，因此拉曼光譜技術可能實現對癌症的早期診斷，進而指導早期治療。

然而，物質自發拉曼光譜信號極弱，且極易受熒光干擾，靈敏度低，應用範圍受到極大限制。表面增強拉曼效應（surface enhanced raman spectroscopy, SERS）的出現解決了這個問題。SERS是通過吸附在金屬納米結構表面上的分子與金屬表面發生的等離子共振相互作用而引起的拉曼散射強度增強的現象，是一種非常有效的拉曼信號檢測技術。SERS技術核心在於增強基底，一般SERS增強因子的平均值約為106，但是在納米粒子的間隙位置和尖銳突起外表面，局部增強可達到1014。然而目前SERS基底的穩定性較差，而基底的細微差異就會使測量結果的變化很大[6]，目前仍無穩定性和重現性均較高的增強基底[7]，仍不適於實際樣品中痕量目標物的定量分析。為此，專家們進行了大量探索研究，如開發不同增強基底[6,8-10]、表面增強納米修飾晶元[11]，開發磁輔助表面增強拉曼散射技術[12]、共焦顯微拉曼技術[13]、表面增強相干反斯托克斯-拉曼散射技術[14]等。也有專家將拉曼光譜技術與內鏡結合對病灶進行實時照射活檢，也表現出不錯的效果[15,16]。已有大量研究表明拉曼光譜檢測技術可實現對卵巢癌[13]、結直腸癌[17]、宮頸癌[18]、前列腺癌[19]等癌症的診斷。但是檢測技術穩定性及重現性欠佳、底物預處理可能影響結果、檢測品類單一等問題仍未得到合理解決[7]。且對於液體樣品而言，檢測靈敏度仍不夠高，通常只能檢測濃度較高的溶液。

液芯波導增強拉曼光譜檢測技術（liquid core waveguide enhanced raman spectroscopy, LOWERS）是通過使激光在液體/波導管界面上形成內部全反射，使其通過樣品的有效光程遠大于波導管的幾何長度，從而顯著提高信號強度、檢測靈敏度和探測極限。LOWERS是一種純光學增強，能實現對液體樣品中不同物質的同步痕量檢測，雖靈敏性略低於應用最廣的SERS，但其穩定性遠高於SERS。以非結晶無定形含氟聚合物（Teflon AF2400）製成的波導管能使LOWERS達到103量級的拉曼光譜信號放大，靈敏度和S/N也成比例增高[20]，尤其適用於水溶液特別是體液檢測。但當波導管液體中因進樣時隨機出現的氣泡使光路中斷時，增強效果會受到顯著影響，進而影響檢測結果。為此，劉霽欣等[21]開發了負壓式LOWERS，可將Teflon AF管中氣泡經由透氣的Teflon AF管壁抽出，避免其對LOWERS信號產生影響，該技術可對微升級液體實現100倍以上的穩定增敏。

2 拉曼光譜檢測技術診斷肺癌

2.1 肺組織拉曼光譜檢測技術診斷肺癌的研究進展

唐偉躍等[22]應用共焦顯微拉曼光譜技術對肺癌及癌旁正常組織切片進行分析，得出兩種組織的譜圖在峰頻移及峰強度方面表現出明顯差異：①正常肺組織切片的1,392/cm附近的C-H變形振動在癌變組織光譜中向高波數移動約6/cm；②1,523/cm脂類胡蘿蔔素的C=C振動譜帶在癌變組織光譜中向高波數移動約3/cm；③在正常組織中1,610/cm處譜帶的強度明顯的強於1,526/cm處譜帶的強度，而在癌變組織中則正好相反。表明組織細胞在癌變過程中在構型、構象和數量上發生了變化，提示該方法在揭示惡性腫瘤的發生髮展規律及其他良性疾病的基礎研究中有著良好的前景。McGregor等[16]團隊開發了快速實時內鏡拉曼光譜檢測系統和專用於肺部檢測的內窺鏡拉曼導管，能使檢測時間縮短到1 s以內[23]，結合自體熒光支氣管鏡+白光支氣管鏡技術，對後兩者篩查出的可疑區域進行拉曼光譜檢測，研究共檢測了80例病人的280例組織（包括72例高度異型性變或惡性病變組織及208例良性或正常組織），結果顯示其對高度異型性變和惡性病變的檢出具有高敏感度（90%）和很好的特異度（65%），檢測快速準確。Weng等[14]採用相干反斯托克斯-拉曼散射技術結合深度學習演算法研究肺癌的自動鑒別診斷，判別正常、小細胞肺癌、腺癌及鱗癌肺組織的準確度能達到89.2%。然而肺組織樣本的獲取創傷大、成本高，實時內鏡拉曼光譜技術操作複雜且創傷大，技術尚不成熟，仍需要大量研究以挖掘其在診斷肺癌及癌前病變方面的潛力。

2.2 呼出氣中揮發性有機物的拉曼光譜檢測診斷肺癌的研究進展

人呼出氣中有超過3,000種揮發性有機物（volatile organic compounds, VOCS），可能有助於早期肺癌檢測[24]。有研究[25-27]證明呼出氣中多種VOCS可作為肺癌相關生物標誌物，有助於肺癌診斷。Zhang等[8]採用基於樹枝狀銀納米晶體的表面增強拉曼光譜技術，利用 「腔窩」效應延長氣態分子在固體表面的反應時間，通過與樹突狀銀納米晶體上預接枝的拉曼活性探針分子對巰基苯胺的親核加成反應，能敏感地捕獲氣態醛分子，並實現十億分率水平的檢測。該方法對肺癌生物標誌物檢測的敏感性不受濕度的影響，這使其在快速、簡便、經濟、無創地判別肺癌方面具有很大的潛力。該團隊也研究了採用基於ZIF-8塗層的金超粒子自組裝體的表面增強拉曼光譜技術捕獲氣態醛，檢出限能達到100億分率水平，顯示了其在早期肺癌體外診斷方面的良好應用前景[9]。VOCS拉曼光譜檢測無創、快速，在肺癌診斷方面表現出了良好潛力，但實際臨床效用仍有較大爭議，相關研究較少，但仍需進一步研究探討。

2.3 唾液拉曼光譜檢測技術診斷肺癌的研究進展

唾液含有大量與體征相關的蛋白質和分泌物質，顯示出對多種疾病診斷的潛力[28]。李曉舟等[29]採用以銀膠為基底的SERS結合倒置顯微拉曼光譜儀檢測肺癌患者和健康人唾液樣本拉曼光譜，以主成分分析（principle components analysis, PCA）和線性判別分析對光譜數據降維和區分，結果顯示從對照組到肺癌組蛋白質和核酸含量的整體下降，人肺癌腫瘤細胞的拉曼光譜也表明核酸和蛋白質相對正常人的下降，表明唾液在某種程度上可以反映組織的狀況，判別肺癌的準確度、靈敏度和特異性分別能達到84%、94%和81%，揭示了唾液SERS用於診斷肺癌的潛力。但是SERS檢測技術的穩定及重現性不佳的問題仍未解決。Liu等[11]採用基於表面增強納米修飾晶元的攜帶型拉曼光譜系統檢測分析肺癌患者和健康人唾液樣本，通過對特徵峰的研究分析發現肺癌患者和健康人唾液中蛋白質分子結構和核酸分子種類及含量上明顯不同，建立的SVM模型和隨機森林模型判別肺癌的靈敏度、特異性、準確度分別為100%、94.44%、98.3%和100%、88.8%、97.4%。唾液樣本獲取方便、完全無創，且在研究中表現出了高特異性、靈敏度及準確度，但是該檢測系統依賴的晶元精度雖高但生產技術尚不成熟，不同批次晶元間的差異較大，穩定性及重現性差。且唾液樣本易受痰液干擾，可能會使結果有所偏倚。

2.4 尿液拉曼光譜檢測在肺癌診斷方面的研究進展

尿液中含有大約3,000種蛋白質，是一種理想的蛋白質和肽類生物標記物研究樣本[30]。Niu等[31]採用氣相色譜/質譜法對尿液樣本進行代謝組學分析，發現尿液中代謝產物共38種，其中有7種能有效指示肺癌，包括肌酐、肌醇、3-羥基丁酸、核苷酸、檸檬酸、十六酸、油酸，除了核苷酸在肺癌組下降外，其餘6種物質在肺癌組水平均高於其他肺部疾病組。也有大量研究表明尿液中GM2AP（GM2-activator protein）[32]、血漿銅藍蛋白[33]、肌酸核苷和N-乙醯神經氨酸[34]、修飾核苷[35]等與肺癌有密切關係，有助於早期肺癌診斷。尿液分析完全無創、取材方便，尿代謝物生物標誌物作為無創臨床篩查工具對肺癌的早期診斷具有潛在的實用價值[36]。金剛烷胺的乙醯化在腫瘤細胞中明顯上調可用於癌症尤其是肺癌的檢測，但由於其在尿液中濃度很低，一般方法難以檢測，有研究[37]採用基於有環式糊精包繞的金屬基底的SERS檢測技術，可實現對肺癌患者尿液樣本中乙醯金剛烷胺的檢測，極限檢測濃度能達到1 ng/mL，且具有成本低、快速的優點，有望成為臨床早期肺癌的診斷手段。此外，腺苷可能是一種癌症相關生物標誌物。人血清是一種含有蛋白質的高度複雜的基質，對腺苷的直接測定有嚴重的干擾作用，而尿液由鹽和小分子組成，如尿素和核苷，適於測定腺苷。Yang等[12]通過合成由植酸及其鹽編織並穩定化的Fe3O4/Au/Ag納米複合材料，開發了磁輔助表面增強拉曼光譜技術，檢測肺癌患者和健康人尿液樣本中痕量水平的腺苷，能達到1×10-10 mol/L濃度的檢測水平，具有靈敏度高、選擇性好、預處理簡單、檢測速度快等優點，可以有效地指示肺癌。但是尿中尿素可造成對腺苷檢測的嚴重干擾，雖然偶氮偶聯能成功去除尿中尿素，但也會嚴重干擾腺苷的SERS信號。這些研究證實了尿液拉曼光譜檢測診斷肺癌的優勢及其可行性，具有良好的應用前景。但是尿液中肺癌相關生物標誌物的種類及含量仍無國際公認標準，尿液背景物質對樣本拉曼信號的干擾仍未得到有效解決，且相關檢測技術不成熟，穩定性及重現性差的問題仍是限制其臨床廣泛應用的瓶頸。

2.5 其他樣品拉曼光譜檢測診斷肺癌的研究進展

Ye等[38]基於某些microRNA[39]可作為肺癌標誌物的研究，開發了基於循環指數擴增反應（EXPAR）的SERS方法，可同時檢測肺癌中的多種microRNA，並能從高度同源的microRNA中區分出目標microRNA，在臨床早期肺癌診斷中有很大的應用潛力。Park等[40]利用SERS分別對NSCLC細胞和正常肺組織細胞來源的外泌體進行檢測分析，旨在實現肺癌的實時診斷，結合PCA判別肺癌細胞來源外泌體的敏感性和特異性分別能達到95.3%和97.3%（95%CI），證實了基於PCA的SERS無創檢測方法可實現判別NSCLC組織細胞來源的外泌體，從而可能實現對肺癌的臨床診斷。近年來關於microRNA和外泌體等在肺癌診斷方面的研究如火如荼，但與拉曼光譜技術結合診斷肺癌的研究很少，給我們提供了新的思路。

3 結語

作為一種非侵入性檢測技術，拉曼光譜檢測技術診斷早期肺癌具有操作簡單、快速有效、靈敏度及特異度高的優點。拉曼光譜檢測技術的發展日新月異，結合不同組織細胞或體液樣本的研究，可實現對肺癌的微創甚至無創檢測，在臨床早期肺癌診斷方面有著廣闊的臨床應用前景。研究開發穩定性及重現性更好、靈敏度及特異度更高的拉曼光譜檢測技術，降低樣本背景干擾對樣本拉曼信號的影響，結合不同拉曼光譜數據的統計處理方法，進而實現肺癌的微創甚至無創的高效檢測是今後科研工作者需要努力的方向。相信隨著相關研究的深入發展，拉曼光譜檢測技術在臨床肺癌早期診斷中必將發揮更加重要的作用。

[田笑如, 張毅. 首都醫科大學宣武醫院胸外科. 拉曼光譜檢測技術在早期肺癌診斷方面的研究進展. 中國肺癌雜誌, 2018, 21(7):560-564.] doi: 10.3779/j.issn.1009-3419.2018.07.10

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