基因檢測臨床指導用藥常見問題解答
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Q：什麼是測序深度、靈敏度、特異性、檢測限?
測序深度：測序量/目標基因區域大小
有效測序深度：不等於測序深度，是指可信的去除重複序列後目標區域的平均深度。比如100k的目標區域，下機數據量1G，有50%數據落在目標區域，50%為重複序列，那麼其測序深度為10000X （1G/100k）,有效深度僅為2500X（1G*50%*50%/100k）。
靈敏度( sensitivity) ：指患者中試驗陽性者所佔比例。對應假陰性率。
計算公式：靈敏度( Sen) = a/( a+ c) % 100%。
特異度( specificity) ：指沒有患病的人中試驗陰性者所佔比例。對應假陽性率。
計算公式：特異度( Spe) = d/ ( b+ d) % 100%。
靈敏度和特異性計算參考表
檢出限：是指樣品中以一定概率可被聲明與零有差異的被測量物濃度的最低值。一般採用 95%(n ≥ 20)的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標準。此項指標體現了試劑檢測的分析靈敏度。
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Q：它們之間的關係？是不是測的越深越好?
提高測序深度能夠增加靈敏度、特異性，同時提高檢出限，但不能突破極限檢出限。DNA的量本身對於測序深度沒有影響，在DNA 量一定的情況下，滿足一定量測序深度後，檢出限存在理論極限值，單純通過增加測序深度並不能降低檢出限，盲目加大測序深度只會產生更多的重複（duplication），造成數據浪費，所以測序深度並非越深越好。
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Q：測序數據錯誤通常會發生在哪些環節?
PCR擴增錯誤，成簇錯誤，合成錯誤，成像錯誤，下機數據的背景錯誤使高通量測序進行低頻檢測時面臨挑戰。
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Q：晚期患者血液中為何有時檢不出ctDNA突變?
1）可能突變低於NGS的檢測限，沒有報出；
2）本身生物學原因：同是晚期患者，體內的腫瘤負荷不一致，腫瘤細胞釋放DNA入血能力不同是導致部分患者血液中ctDNA突變頻率低；
3）不同癌症的檢出率有所不同，主要由於不同癌症釋放DNA入血能力不同導致。另外，腦部腫瘤由於腦血屏障，釋放到血液的DNA很少。
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Q：組織有檢出，血液中沒有檢出是什麼原因?
對於一些腫瘤，組織和血液的一致性很高，但是還有很多時候會出現組織有檢出，血液中沒有檢出，一個原因可能是組織入血不夠的問題，導致檢出率較低；另一個原因可能是在組織中是主克隆的突變，血漿中往往能檢出，而在組織中是亞克隆的，檢出率就會低，也就是說，血漿體現了組織的異質性問題。
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Q：患者檢出有敏感突變，效果卻不好是為什麼?
首先考慮是否檢測錯誤，出現假陽性；另外可能與患者自身體質有關，用藥後吸收不好，導致真正到達體內發揮作用的藥物濃度低，無法正常發揮作用；還有一個原因可能就是A5中提到的突變會存在主克隆和亞克隆導致的，因為如果查出的不是主幹突變，而只是分支上的突變，那麼患者所用的葯只對分支突變有效，卻不能整體表現出很好的療效，或者，其他分支的突變還有可能引起耐葯的發生，組織檢測也是導致檢測不全面的原因之一。因此血液和組織互補檢測具有更好的臨床應用價值。
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Q：是否可不用做基因檢測直接進行免疫治療?
1）免疫治療整體的響應率、有效率較低，TMB/MSI/PD-L1表達等biomarker雖然能夠預測免疫治療療效，但遠遠不夠，需要有更多的biomarker來預測。有很多研究報告，大panel中的很多基因突變代表了更好的治療效果，如DNA錯配修復通路基因，POLE/POLD1基因，DNA損傷修復通路基因，KRAS+TP53，PBRM1基因，這些突變在一定條件上是對免疫治療有利的，而另外一部分基因卻是對免疫治療不利，如非小細胞肺癌中的RET，STK11，LKB11，EGFR，ALK等；
2）除了預測療效的biomarker，還有一些突變代表著免疫治療無效，預後差甚至是超進展，如大panel中的驅動基因突變，可能表示無法獲益。而MDM2擴增等基因突變可能會導致超進展，需要通過動態檢測來監測免疫治療療效，進而指導臨床決策；
3）因為目前免疫治療沒有特別明確的biomarker，需要用大panel來進行檢測來探索更多的可能預測標誌物；
4）可以通過一種基因檢測來挑選「響應者」能夠加速免疫療法在腫瘤治療當中的應用，使免疫治療更有效，一項研究中，分析了收集自360名晚期前列腺癌患者的腫瘤DNA。結果顯示，7%的患者腫瘤中缺失了CDK12基因的拷貝，與其他形式的晚期前列腺癌相比，具有這種突變特徵的腫瘤含有更多的免疫細胞及新抗原，而且在一項小型試點臨床研究中，4名腫瘤擁有與CDK12相關的基因變化的晚期前列腺癌患者中，有2人對pembrolizumab產生了顯著的響應。
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Q：免疫治療在肺癌當中如何更好使用?
1）當存在驅動基因突變時，優選靶向治療，激酶抑製劑/單葯/序貫單葯治療，這種情況可以小範圍內謹慎選擇免疫治療，有研究表明，驅動基因突變的免疫治療，大部分發生疾病進展，很少部分出現了部分緩解或完全緩解，總體的PFS只有2.8個月；
2）無可用靶向藥物的驅動基因突變，或者KRAS突變時，可考慮免疫治療；
3）應該等靶向治療選擇窮盡之後再選擇免疫治療。
以上見解如有不足歡迎各位讀者補充和建議。
- 參考文獻
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