《自然》子刊：顛覆認知！科學家揭示CRISPR/Cas9切口全新連接機制，未來有望實現精準連接｜科學大發現

「再一次一無所知，從頭開始……這讓我很開心。」——斯托帕德《阿卡狄亞》

從2013年張鋒[1]和George Church[2]第一次使用CRISPR-Cas9編輯人體細胞算起，這項技術在人體細胞中的使用已經走過5個年頭。

雖然CRISPR被科學家使用的很溜，並已經走到臨床試驗階段；但我們對Cas9的切割原理和切割後細胞修復機制的了解還比較少，甚至可以說它們還是個黑盒子。

前不久，上海交通大學吳強教授課題組在Molecular Cell上發表了一篇文章，他們發現Cas9切割DNA雙鏈可以產生突出末端，而不僅僅是平頭末端，這顛覆了我們對Cas9切割的認知[3]。

近日，加州大學伯克利分校的Jacob Corn團隊在Cas9切割後的修復機制上也取得了顛覆認知的重大突破。

通訊作者Jacob Corn（後排右四），第一作者Chris Richardson（後排右五）

總的來說，Corn團隊這次解決了一個長期困擾科學家的問題：用CRISPR-Cas9切斷細胞的DNA之後，細胞究竟是如何選擇用哪種方式修補斷裂的缺口的？

更重要的是，他們的這個發現甚至可以讓科學家以後根據自己的需求，操縱細胞的修復方式，讓細胞基因組DNA在被Cas9切斷後，按照需求去修復缺口。正真實現精準切割，精準修補。

這對很多需要做基因修復的遺傳疾病而言，無疑是個好消息。上周四，Corn團隊的這一重要研究成果發表在《自然遺傳學》上[4]。

一直以來，我們都形象地把CRISPR-Cas9叫做「上帝的手術刀」，而不把它叫做「上帝的針線包」，主要是因為Cas9隻負責精準的切斷DNA，修復的任務要交給細胞自身。

通常情況下，CRISPR-Cas9切斷DNA形成的雙鏈斷裂後，細胞會很快啟動緊急修復機制。其中最主要的兩條是：非同源末端連接和同源重組。

其中非同源末端連接修復機制被科學家用的最多，效率也最高。它就是不管三七二十一，儘快把斷裂的DNA連接起來，維持DNA的穩定。這種修復方式絕大部分情況下會在切割位點產生隨機插入或缺失，直接導致基因功能喪失。

無論如何，對細胞而言，損失一個基因，比掛了肯定好多了。這種修復方式其實也是細胞的最常見修復方式。鑒於這種修復方式的特點，它被廣泛用於基因功能的研究。

而同源重組修復機制，則是在有同源供體DNA序列的配合下，用一段正確的基因序列替換原本錯誤的基因序列[5]。也就是我們常說的：哪裡壞了，換哪裡。科學家和醫生治療基因變異導致的疾病，依賴的就是這種修復方式[6]。

目前，同源重組修復過程中使用的外源DNA模版有兩種：一種是雙鏈DNA，另一種是單鏈DNA模版修復（SSTR）。

CRISPR/Cas9切斷DNA之後的可能修復機制

不過，大量的研究表明，把雙鏈DNA作為模版修復斷裂的DNA在絕大多數細胞類型中是非常低效的[7]。相較而言呢，以單鏈DNA為修復模版的SSTR模式在人類細胞中倒是很高效[8]，所以使用的也比較多。

雖然SSTR效率高，但是Corn團隊在不同的人類癌細胞系中做研究還是發現，SSTR的修復效率還是有很大的差異，從完全無效的0%，到非常高效的30%。這似乎暗示，SSTR是否能完成修復與細胞類型有一定的關聯。

再仔細一想呢，不同細胞類型的基因表達水平實際上是相差很大的，是不是某些特殊的DNA修復通路的打開或關閉，影響了SSTR修復的效率呢？

不同模版的修復過程

如果我們能發現影響SSTR修復機制的相關基因，那麼在以後的臨床應用中，在編輯基因的同時，特異性的調節相關基因的表達水平。那轉化效率就可以大幅提升，治療效果也會穩步提升啊。

研究人員趕緊去查查相關資料。

很幸運，SSTR在人體中修復的機制還鮮為人知。如果能解決這個困擾著很多科學家的問題，那麼Corn團隊肯定很開心。

此處應該再次出現斯托帕德那句話：「再一次一無所知，從頭開始……這讓我很開心。」

Corn團隊的研究人員究竟有多開心我是沒辦法知道了。不過，當我看到他們解決問題的思路時，我何止是很開心，簡直是很興奮，以至於喝了5杯濃茶也沒驅散的午間睡意，瞬間消散。

他們首先做了一個假設：既然是DNA斷裂的修復出現了不穩定的問題，那問題應該就處在細胞內跟DNA修復有關的基因上；如果在調控那些修復基因表達的同時，同步開展CRISPR-Cas9的剪切，和切斷後的SSTR修復，不就可以通過二者之間的相互作用找到影響SSTR的關鍵基因了嗎！

於是，研究人員首先找到了2000多個跟DNA修復有關的基因。然後做了一個非常聰敏的設計。

他們創造性的使用了CRISPRi基因沉默技術[9]、CRISPR-Cas9基因編輯技術和熒游標記技術，創建了一個可視化的「沉默-編輯」平台。

首先，他們給所有的細胞加了個藍色熒光基因，讓這些細胞發藍光。

所有的細胞都藍瑩瑩的，真好看~

然後，給這些細胞分別裝入用來沉默修復相關基因的CRISPRi基因沉默系統。每個細胞沉默掉一個修復相關基因，在一個有數百萬個細胞的群體中，就產生了2000個基因分別被沉默掉的細胞庫。

建庫過程

緊接著，研究人員就要對那個藍色熒光蛋白基因下手了。

他們把靶向切割藍色熒光蛋白基因的CRISPR-Cas9編輯系統，以及一個與藍色熒光蛋白基因有同源臂的綠色熒光蛋白基因的單鏈DNA，一起轉到上面的那個細胞庫里。

接下里會發生什麼，你們肯定能想到把，還需要我說嗎~

忍不住了，我還是說下吧。

理想狀況下（我們只說理想狀況下），上面的細胞庫顏色會發生如下變化。有些還是藍色，意味著基因編輯失敗；有一些細胞沒有顏色了，大概率意味著意味著Cas9把藍色熒光蛋白基因切斷了，然後細胞按照非同源末端連接的方式又把它隨便連上了，導致基因功能喪失了；剩下的細胞成功變綠了，這些細胞實現了SSTR修復。

研究人員用流式細胞儀按照顏色，給所有的細胞分分成三撥：有6.8%的細胞還保持這藍色，有67.5%的細胞不顯色了，22.8%的細胞變成了綠色。

加起來是97.1%，還有2.9%的細胞怎麼了？這些細胞出現了理想狀況之外的情況，我們就不管它們了。

編輯後的細胞顏色分布

有了上面的細胞。接下來的事情就好辦了，用二代測序技術，分析分析這三個細胞群體中gRNA的水平變化，就可以知道哪些基因會影響SSTR的效率了。

這一分析不要緊，研究人員發現之前認為與SSTR修復有關的DNA修復基因，似乎與SSTR關係並不大。

讓研究人員意外的是，那些處在范科尼貧血（Fanconi anemia；FA）的通路上的基因，與SSTR關係密切。

范科尼貧血是瑞士兒科醫生Guido Fanconi在1927年首次報道的，它是一種罕見的常染色體隱性遺傳性血液系統疾病[10]。1992年報道了4個可能與FA相關的基因，到現在已經鑒定出了20多個與FA的發病有關的基因變異。

FA通路涉及超多蛋白

一直以來，研究人員認為，FA通路上的基因編碼的蛋白與識別和修復基因組中的鏈間交聯（ICL）有關。並不認為它與CRISPR-Cas9導致的DNA雙鏈斷裂修復有關。

這個發現，被研究人員視為至寶。

為了進一步證實FADNA修復通路上的蛋白與SSTR修復模式效率之間的關係。研究人員用CRISPRi分別穩定地敲低了FA路徑中的FANCA，FANCD2，FANCE，FANCF，FANCL，HELQ，UBE2T，USP1和WDR48。發現SSTR修復模式效率顯著下降。

如果在敲低的同時，用cDNA在細胞內穩定地表達那個敲低的蛋白，讓它們的表達恢復到野生的水平。研究人員發現，SSTR修復模式效率提升8倍，回升到正常水平。

這些研究表明，FA通路中的許多基因對SSTR修復模式是必需的。

更有意思的是，研究人員還發現FA通路隻影響SSTR，它不會促進非同源末端連接。總體來說，在DNA被切斷之後，細胞修復DNA的首選方式是非同源末端連接，這也是為什麼這種修復方式一直比例最高。

FA通路就是個

而FA通路更像個「交通信號燈」：在FA通路不活躍的時候，所有的車都朝一個方向（非同源末端連接）開；但如果FA通路很活躍，那麼它就要指揮其中一部分車往另一個方向（SSTR）走。

原來是這樣！

用論文第一作者Chris Richardson的話說，就是「FA通路是維持非同源末端連接和SSTR之間平衡的」。

「治療鐮狀細胞貧血，成功的機會與用正確的基因替代突變的基因效率密不可分，」Richardson這麼評價自己的研究[11]，「如果你從患者那裡獲得了100萬個細胞，30%-40%的替換率肯定比10%的好多了。」

現在看來，Richardson的願望真的有可能實現了。

將來，科學家可以通過分析細胞基因的表達水平，提前預知一類細胞是否適合SSTR。如果這類細胞SSTR效率低，甚至可以考慮臨時激活FA通路。

無論如何，科學家掌握了Cas9切割後的這層修復機制，未來給患者換個基因啥的，那簡直是效率高多了。

編輯神叨叨

CRISPR在臨床中的應用，盡在Medical Trend。

參考資料：

[1]. Cong L, Ran F A, Cox D M, et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems[J]. Science, 2013, 339(6121): 819-823.

[2]. Mali P, Yang L, Esvelt K M, et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9[J]. Science, 2013, 339(6121): 823-826.

[3]. Shou J, Li J, Liu Y, et al. Precise and Predictable CRISPR Chromosomal Rearrangements Reveal Principles of Cas9-Mediated Nucleotide Insertion[J]. Molecular cell, 2018.

[4]. Richardson C D, Kazane K R, Feng S J, et al. CRISPR–Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anemia pathway[J]. Nature Genetics, 2018: 1.

[5]. Sternberg S H, Doudna J A. Expanding the Biologist"s Toolkit with CRISPR-Cas9.[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4): 568-574.

[6]. Cox D B, Platt R J, Zhang F, et al. Therapeutic genome editing: prospects and challenges[J]. Nature Medicine, 2015, 21(2): 121-131.

[7]. Chen F, Pruettmiller S M, Huang Y, et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases[J]. Nature Methods, 2011, 8(9): 753-755.

[8]. Richardson C D, Ray G J, Dewitt M A, et al. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA[J]. Nature Biotechnology, 2016, 34(3): 339-344.

[9]. Gilbert L A, Larson M H, Morsut L, et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.[J]. Cell, 2013, 154(2): 442-451.

[10]. Walden H, Deans A J. The Fanconi Anemia DNA Repair Pathway: Structural and Functional Insights into a Complex Disorder[J]. Annual review of biophysics, 2014, 43(1): 257-278.

[11]. http://news.berkeley.edu/2018/07/30/dna-repair-after-crispr-cutting-not-at-all-what-people-thought/

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本文作者 | BioTalker

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