非洲豬瘟疫苗研究進展
文章來源
王西西,陳青,吳映彤,郭曉宇,李金祥.非洲豬瘟疫苗研究進展.中國動物傳染病學報,2018,26(2):89-94.
摘 要：非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，可感染各品種及年齡段家豬以及歐洲野豬，死亡率高達100%。近年來，非洲豬瘟在北高加索地區、俄羅斯境內多個州以及東歐多國擴散、流行，在全球分布呈擴大趨勢。2018年8月3日，中國遼寧省瀋陽市確診國內首例非洲豬瘟疫情。由於非洲豬瘟病毒擁有龐大的基因組結構和複雜的免疫逃逸機制，使得該病目前仍未有有效疫苗問世。本文針對非洲豬瘟滅活疫苗、減毒活疫苗、病毒活載體疫苗、核酸疫苗和基因工程亞單位疫苗等研究進展進行概述，以期為該病疫苗研發提供參考。
非洲豬瘟病毒（Africanswine fever virus，ASFV）是一種核質巨DNA病毒，在病毒分類中隸屬於DNA病毒目、非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬，為該科唯一成員，且是目前唯一已知的蟲媒DNA病毒。ASFV病毒粒子具有雙層囊膜結構，基因組為線性雙鏈DNA分子，不同毒株之間基因組大小存在一定差異，總體介於170～190 kb之間。ASFV基因組可編碼150多個開放閱讀框，成熟病毒粒子中含有50種以上結構蛋白。ASFV主要通過巨胞飲以及網格蛋白介導的胞吞作用感染宿主單核巨噬細胞系統。根據毒力的不同可將ASFV分為高致病性、中等毒力、低毒力以及感染無臨床癥狀毒株等。非洲豬瘟（African swine fever，ASF）臨床病例中以高致病性病毒感染最為常見，其發病率和死亡率可達100%。因此，OIE將ASF列為必須報告的動物疫病，我國也將其列為一類動物疫病。
20世紀中前期，ASF主要在非洲大陸豬群中傳播，1957年之後傳入歐洲多個國家，包括葡萄牙、西班牙、義大利和法國等，給養豬業造成巨大損失。20世紀90年代中期，除了仍在義大利的撒丁島流行，ASF在歐洲已消失。2007年，ASF在高加索地區和俄羅斯暴發並持續流行，疫情延至東歐多國，再次突顯了ASF對全球養豬業的巨大威脅。由於ASFV強毒株基因組可編碼多種蛋白質，用以干擾宿主的天然免疫系統，從而抑制和逃避宿主的免疫應答反應，為自身的增殖、擴散創造有利條件,使得ASF至今尚無有效疫苗用於防治，因此疫苗的研發對控制該病具有重大意義。針對ASFV疫苗的研究始於20世紀60年代，ASFV擁有龐大的基因組結構和複雜的免疫逃逸機制，給疫苗研發工作帶來諸多困難。
隨著現代分子生物學、免疫學和疫苗學技術快速發展，以及對病毒與宿主免疫系統互作機制的深入研究，ASF疫苗研製取得了較大進展。本文對主要的ASF滅活疫苗、減毒活疫苗、病毒活載體疫苗、核酸疫苗以及基因工程亞單位疫苗等研究進展進行概述，以期為ASF疫苗開發提供參考。
滅活疫苗
傳統病毒疫苗可通過病毒滅活和病毒致弱兩種方法進行製備。滅活疫苗通過物理或化學手段將病原滅活，使其失去感染能力，但保留其抗原性。迄今為止，採用多種傳統方法製備的ASF滅活疫苗均不能對強毒攻擊提供有效的免疫保護，包括病毒接種肺泡巨噬細胞以及感染脾組織後勻漿製備的滅活疫苗。雖然用ASF滅活疫苗免疫後可產生高效價的抗體，但很難檢測到中和抗體的存在。Blome等研究表明，即使用新型佐劑Polygen?或Emulsigen(?)-D等與ASFV滅活抗原進行配伍，免疫動物後能夠誘導產生ASFV特異性抗體，但仍未能提高疫苗的免疫保護效力。這可能是由於產生的ASFV特異性抗體並不具有中和活性，提示細胞免疫在ASF疫苗免疫保護中起重要作用。此外，Gómez-Puertas等研究人員也證實在細胞傳代過程中，低代次和高代次的ASFV毒株對中和抗體的敏感性存在差異。鑒於現有研究結果，採用傳統方法研製有效的ASF滅活疫苗困難很大。
減毒活疫苗
根據減毒活疫苗毒株來源不同，可將ASF減毒活疫苗毒株分為三類：傳代致弱毒株、天然致弱毒株和重組致弱毒株。減毒活疫苗能夠誘導強烈持久的免疫應答，但生物安全是其使用的主要限制因素。採用分子生物學手段，可通過基因重組、靶向缺失以及一次性侵染技術來增強減毒活疫苗的安全性。
傳代致弱毒株
ASFV可經過豬骨髓來源細胞、Vero和COS-1等細胞系傳代致弱。傳代過程中，ASFV致病力逐漸下降，同時病毒免疫原性和穩定性也隨之下降。在西班牙和葡萄牙，使用傳代致弱毒株免疫動物後產生了災難性的後果，免疫動物呈現出肺炎、流產和死亡等副作用，在田間多次感染和異源強毒株存在的條件下，許多免疫動物呈現ASF慢性感染臨床癥狀。因此，傳代致弱毒株的致病性導致此類疫苗的開發一度受阻。Krug等利用分離株ASFV-G在Vero細胞中進行傳代培養，隨著傳代次數的增加，ASFV-G在Vero細胞中的複製能力增強，同時在豬原代巨噬細胞中的複製能力下降，病毒毒力逐漸衰減，在傳至第110代時完全喪失。家豬接種完全致弱的ASFV-G毒株後並未獲得相應保護力以抵抗母本病毒的攻擊，表明傳代致弱的ASFV安全性較差且很難提供較好免疫保護。
天然致弱毒株
採用天然致弱ASFV毒株OURT88/3或NH/P68免疫動物後，能誘導產生對同源強毒株的攻毒保護，依據實驗動物和攻毒毒株的不同，保護率介於66%～100%。研究表明，病毒特異性抗體以及CD8+T細胞在免疫保護中均起重要作用，且OURT88/3毒株產生的免疫保護與病毒特異性IFN-γ產生細胞呈正相關性。採用NH/P68免疫後，豬對高毒力ASFV/ L60感染抵抗力增強。以OURT88/ 3免疫並用致病性OURT88 / 1毒株進行加強免疫後，可誘導機體產生針對ASFV I型不同分離毒株的交叉保護，表明研製具有交叉保護的ASFV疫苗是可能的。然而，天然致弱毒株免疫動物後可造成諸多副反應，包括肺炎、流產、死亡等，免疫NH/P68毒株後25%~47%的豬呈現慢性感染；免疫OURT88 / 3後可導致發熱、關節腫脹等癥狀。總之，天然致弱毒株導致的諸多副反應以及存在散毒的可能性等生物安全隱患限制了其在實際生產中的進一步應用。
重組致弱毒株
採用分子生物學方法，敲除病毒功能基因、病毒毒力基因或者免疫抑制基因，可降低病毒毒力或增加機體對病毒的免疫應答，研製比傳統弱毒疫苗安全性更好且效力更高的基因工程減毒活疫苗。研究表明一些ASFV毒株在缺失單個或多個毒力基因或免疫抑制基因後，如TK（K196R）、9GL（B119L）、CD2v（EP402R）、DP148R、NL（DP71L）、UK（DP96R）和多基因家族360和505（MGF360/505），缺失毒株接種宿主毒力減弱且可誘導產生針對同源母本毒株或異源毒株的特異性免疫保護（表1）。ASFV編碼多種蛋白以干擾宿主免疫系統，已報道的病毒免疫逃逸相關基因包括A238L、A179L、A224L、DP71L、MGF360/505、I329L、K205R、D96R、DP148R、A276R、D96R和EP153R等，其編碼蛋白抑制宿主細胞Ⅰ型干擾素和ISGs的產生，調控細胞凋亡、蛋白合成和自噬等多種信號通路。由於這些蛋白質可干擾宿主免疫應答，從ASFV強毒株中缺失上述基因有助於增強宿主免疫應答（表1）。
安全性和有效性是影響ASF弱毒活疫苗田間應用的重要因素，安全性和有效性與病毒毒株、免疫或感染劑量、病毒接種途徑以及接種動物密切相關。因此，致弱毒株保護性的強弱、是否有毒力殘留和是否導致持續感染是弱毒活毒株能否成為候選疫苗毒株的重要決定因素。因此，還需要進一步研究以確定適合的缺失靶基因及其組合，以研製可誘導保護性免疫反應且沒有相應副作用的ASFV弱毒活疫苗。
減毒活載體疫苗
已有研究表明，細胞免疫和體液免疫在抗ASFV感染中發揮作用。有學者將ASFV保護性抗原重組入腺病毒或痘病毒載體，以期獲得更好的細胞免疫和CTL反應。Lokhandwala等將ASFVp32、p54、p72和pp62基因分別重組入人腺病毒Ad5載體中進行「雞尾酒」式免疫，獲得了良好的抗原特異性CTL反應；之後他們又將ASFVA151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR、B438L和K205R-A104R共7個ASFV抗原基因，重組入複製缺陷型腺病毒載體，通過「雞尾酒」式混合免疫後能夠誘導強烈體液免疫反應和細胞免疫應答。上述研究仍需通過攻毒保護試驗進一步驗證病毒活載體疫苗在ASF疫苗開發中的可行性。
核酸疫苗
ASF核酸疫苗的研究剛剛起步，通過將編碼病毒主要抗原的基因克隆入真核表達載體後直接導入機體內，在宿主細胞內完成轉錄翻譯後產生抗原蛋白，從而同時激活體液免疫和細胞免疫應答。Argilaguet等將ASFV p72、p30和p54基因克隆入真核表達載體，製備ASF DNA疫苗，但該DNA疫苗免疫豬後並不能夠提供攻毒保護。同組科研人員將ASFVp30和p54基因與豬白細胞抗原II的特異性抗體單鏈可變區基因在真核表達載體中融合表達；接種ASF DNA疫苗後，在沒有誘導產生可檢測水平ASFV抗體的情況下，能夠使部分動物獲得攻毒免疫保護，表明細胞免疫在ASFV疫苗的免疫中起重要作用。最新研究表明，根據一個或兩個ASFV抗原構建的DNA疫苗並不能誘導較高免疫保護，而免疫ASFV基因組DNA質粒表達文庫能夠提供60%的保護力，說明有待於發掘更多保護性抗原，以提高核酸疫苗的保護水平。
亞單位疫苗
ASF亞單位疫苗只包含特定的病毒抗原，需通過合適抗原傳遞系統免疫動物。鑒定可以引起強烈的免疫應答的抗原及其表位，有助於開發有效的ASFV亞單位疫苗。研究表明，針對病毒p30蛋白的抗體在細胞水平抑制超過95％的ASFV內化，p72和p54的抗體能夠抑制病毒吸附，表明這些蛋白在ASFV感染中發揮作用。用重組p30或p54蛋白免疫豬後可以誘導中和抗體的產生，但不能提供針對急性ASF感染的保護；相比之下，同時免疫p30和p54蛋白或兩種蛋白的嵌合體可以提供部分保護。用桿狀病毒表達系統製備的ASFV結構蛋白p72、p30和p54等，以蛋白複合物作為抗原免疫動物後仍不能提供有效的免疫攻毒保護，說明僅僅依靠上述抗原刺激產生的中和抗體很難獲得理想的免疫保護效果。在另一組研究中，Lopera-Madrid等分別以人源293(HEK)細胞表達的ASFV B646L (p72)、E183L(p54)和O61R (p12)亞單位抗原，或者痘苗病毒載體疫苗進行首免和加強免疫，獲得較好的體液免疫和細胞免疫水平。因此，需要研究鑒定更多的ASFV保護性抗原、開發新型免疫佐劑以及採用DNA首免蛋白質加強免疫策略，以提高ASF基因工程亞單位疫苗的免疫效力。
展望
2017年初至今，俄羅斯境內多個州發生ASF疫情，其中，伊爾庫茨克州、鄂木斯克州發生地點距離我國邊境較近。2018年8月3日，中國遼寧省瀋陽市確診國內首例非洲豬瘟疫情，研發安全有效ASF疫苗也迫在眉睫。過去的幾十年中，對ASF疫苗的研究雖取得了較大進展，包括評估細胞傳代致弱、自然致弱、基因缺失等ASFV疫苗，但是所有努力都未能研製出可應用於實際生產的疫苗。通過基因重組技術，獲得安全、高效ASFV減毒活疫苗仍是ASFV疫苗開發的首選策略。然而，仍有一些問題需要考慮，包括弱毒疫苗在體內的安全性研究，以及鑒定並開發適合弱毒活疫苗生產的細胞系等。研發可鑒別野毒感染和疫苗免疫的ASF亞單位疫苗、病毒活載體疫苗、核酸疫苗、以及複製缺陷型疫苗也是研發ASFV疫苗的重要策略，尤其是在沒有疫病流行地區的使用。與減毒活疫苗相比，這些疫苗的生物安全性有所提高，但鑒定病毒保護性抗原、有效的遞送機制以及高效的免疫佐劑都需要長期的研究和探索。
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