SNP檢測方法盤點
SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個鹼基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多。隨著精準醫學的提出，SNP在比較個體間基因差異、疾病相關基因診斷、藥物開發與合理用藥中的作用被進一步提升。
1 什麼是SNP?
單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由於單個核苷酸鹼基的改變而導致的核酸序列的多態性。在不同個體的同一條染色體或同一位點的核苷酸序列中，絕大多數核苷酸序列一致而只有一個鹼基不同的現象，即SNP，它包括單鹼基的轉換，顛換、插入及缺失等形式。
2 SNP檢測方法有哪些？
SNP檢測方法眾多，大約有20多種。總體來說，檢測SNP大概有3種途徑:a通過檢測未知突變(以構象為基礎)途徑，比如變性梯度凝膠電泳(DGGE)、化學或酶錯配修飾分析、單鏈構象多態性(SSCP)、變性高效液相色譜等; b通過已知多態性檢測(以凝膠為基礎)途徑，包括PCR，RFLP、寡核苷酸連接分析等;c通過檢測非凝膠高通量途徑，包括TaqMan核酸酶等位基因特異性雜交分析、DNA晶元、直接測序和質譜技術等。目前針對消費者SNP檢測應用最為廣泛的為DNA晶元法，包括Thermo Fisher公司的原位晶元和Illumina公司的微珠晶元。
3 不同檢測方法的檢測原理是什麼？
3.1 限制性片段長度多態性法PCR-RFLP：
原理：利用限制性內切酶的酶切位點的特異性，用兩種或兩種以上的限制性內切酶作用於同一DNA片斷，如果存在SNP位點，酶切片斷的長度和數量則會出現差異，根據電泳的結果就可以判斷是否SNP位點。
特點：該技術應用的前提是SNP的位點必須含有該限制內切酶的識別位點，它是SNP篩查中最經典的方法之一。
3.2 單鏈構象多態性法PCR-SSCP：
原理：單鏈DNA在中性條件下會形成二級結構，不同的二級結構在電泳中會出現不同的遷移率。這種二級結構依賴於鹼基的組成，單個鹼基的改變也會影響其構象，最終會導致在凝膠上遷移速度的改變。在非變性聚丙烯醯胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其單鹼基序列的不同而形成不同的構象，這樣在凝膠上的遷移速率不同，出現不同的條帶，檢測SNP。
特點：由於該方法簡單快速，因而被廣泛運用於未知基因突變的檢測。這種方法的弊端在於不能確定突變類型和具體位置。
3.3 等位基因特異性PCR
原理：根據SNP位點設計特異引物，其中一條鏈(特異鏈)的3′末端與 SNP位點的鹼基互補(或相同)，另一條鏈(普通鏈)按常規方法進行設計，因此，AS-PCR技術是一種基於SNP的PCR標記。因為特異引物在一種基因型中有擴增產物，在另一種基因型中沒有擴增產物，用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴增產物的有無，從而確定基因型的SNP。
3.4 SNaPshot法
該技術基於熒游標記單鹼基延伸原理的分型技術，也稱小測序，主要針對中等通量的SNP分型項目。在一個含有測序酶、四種熒游標記ddNTP、緊臨多態位點5』-端的不同長度延伸引物和PCR產物模板的反應體系中，引物延伸一個鹼基即終止，經測序儀檢測後，根據峰的移動位置確定該延伸產物對應的SNP位點，根據峰的顏色可得知摻入的鹼基種類，從而確定該樣本的基因型。對於PCR產物模板可通過多重PCR反應體系來獲得。通常用於10-30個SNP位點分析。
3.5 SNPlex法
SNPlex法是基於熒光檢測方法來進行，原理如下：DNA 模板直接與一套3個探針組成的系統結合，這 3個探針包括 2個等位基因特異探針ASO 和1個位點特異探針LSQ[IO]。當ASO探針和 LSO探針與模板完全匹配時，連接酶連接兩條探針。然後，使用生物素標記的PCR引物擴增該連接產物。生物素標記的擴增產物結合在鏈霉親和素包被的雜交板孔中，通過鹼變性的方法使生物素標記的單鏈PCR產物保留在雜交板中，然後該單鏈PCR產物與一套通用Zipchute探針雜交結合。這些探針帶有熒游標記，它們具有特殊的片段與單鏈PCR產物的特殊部位互補，還包含有修飾部分，一條Zipchute探針對應一個待檢測等位基因。然後將雜交捕獲到的Zipchute探針分離出來，通過毛細管電泳進行檢測，最後通過 GeneMapper軟體分析來確定SNP基因型。
3.6 TaqMan探針法
針對染色體上的不同SNP位點分別設計PCR引物和TaqMan探針，進行實時熒光PCR擴增。探針的5』-端和3』-端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。當溶液中存在PCR產物時，該探針與模板退火，即產生了適合於核酸外切酶活性的底物，從而將探針5』-端連接的熒光分子從探針上切割下來，破壞兩熒光分子間的PRET，發出熒光。通常用於少量SNP位點分析。
3.7 測序法
原理：測序法可以分為Sanger測序法、焦磷酸測序法、微測序法、二代測序法。以二代測序法為例，通過對不同個體同一基因或基因片段進行測序和序列比較，以確定所研究的鹼基是否變異，其檢出率可達100%。
特點：可以得到SNP的類型及其準確位置等SNP分型所需要的重要參數。目前檢測分為約為1-2萬人民幣左右。
3.8 晶元法
原理:基因晶元是在固相支持介質上進行分子雜交並原位熒光檢測的一種高通量 SNP 分析方法。根據核苷酸的鹼基配對原理，設計兩種或多種探針，在優化操作後，探針只與其完全互補的序列雜交，不與含有單個錯配鹼基的序列雜交。待測基因經提取擴增、熒光化學標記後，與固定的探針進行雜交。然後洗去沒有發生雜交的樣品，即可檢測雜交樣品。由於目標基因和探針雜交的程度與熒光強度及種類相關，因此通過激光掃描，可根據熒光強弱或熒光的種類檢測出被檢序列的鹼基類別。目前的生產SNP晶元的公司主要有Thermo Fisher、Illumina和Agilent。但是三個公司各自的檢測原理不盡相同。
特點：其優點是高通量，一次實驗可對多個進行大規模篩選，需要少量的被檢起始材料，操作步驟簡便。目前檢測費用在1000元以內。其中23魔方，WeGene的檢測費用在500元以內，市場空間巨大。
3.9 飛行質譜儀(MALDI-TOFMS)檢測
原理：是將變性的單鏈PCR產物通過與硅晶元上的化合物共價結合後，在硅晶元上進行引物的退火，延伸反應，突變部位配對的鹼基與正常配對的鹼基不相同。根據引物在延伸反應中所結合的不同鹼基的不同質量在質譜儀上顯示不同峰而檢測SNP。
3.10 變性高效液相色譜(DHPLC)法
原理：目標核酸片段PCR擴增，部分加熱變性後，含有突變鹼基的DNA序列由於錯配鹼基與正常鹼基不能配對而形成異源雙鏈。因包含錯配鹼基的雜合異源雙鏈區比完全配對的同源配對區和固定相的親和力弱，更易被從分離柱上洗脫下來，從而達到分離的目的。SNPs的有無最終表現為色譜峰的峰形或數目差異，依據此現象可很容易從色譜圖中判斷出突變的鹼基。
特點：使用高效液相色譜檢測SNPs具有檢測效率高，便於自動化的優點，對未知SNPs的準確率可達95%以上。但DHPLC檢測對所用試劑和環境要求較高，容易產生誤差，不能檢測出純合突變。
4 SNP檢測未來的方向在哪裡？
一個理想的檢測 SNP 的方法必須具備以下優點: a適合自動化操作，簡便、迅速; b分析費用低，特殊試劑用量少; c即使不純的樣品也可得到可靠的結果; d數據分析簡單，易於自動化分析; e反應的通量要大而靈活，一天可以完成幾百到上百萬個樣品。目前報道的SNP檢測方法中，儘管有些方法成本低，但速度慢，且不適合自動化分析; 有些方法可自動化高通量分析，但製備探針成本高。總的來說，伴隨著分子生物學技術的突破，定將會有更多的SNP檢測技術和方法不斷湧現，SNP的應用價值將會不斷得以發掘和體現，人類SNP的研究及應用將會在遺傳及醫學領域中的發揮重要作用。
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