丁世家：用於超靈敏檢測融合基因的基於DNA自組裝水凝膠和鏈霉親和素包封的無酶無標記表面等離子體共振生物感測器

表面等離子共振（SPR）作為一種實時、無標記的檢測技術已應用於生物分子的臨床分析。然而，SPR無法測量折射率的極小變化，因此在實際應用中提高其靈敏度仍是一項挑戰。目前已有多種擴增方法被應用以提高SPR生物感測器的靈敏度，其中能夠構建多種納米結構的無酶DNA自組裝因其設計靈活，大小和方向可控，易於生物偶聯且具有良好的生物相容性等優點已經得到廣泛的研究及應用。

基於此，重慶醫科大學丁世家教授團隊將具有強生物適配性、高度靈活性及可調控性的DNA水凝膠與功能核酸中的適配體相結合，以挖掘高效的信號放大策略為目的，搭建了基於DNA自組裝的適配體水凝膠並包封有鏈霉親和素（SA）的無酶、無標記的SPR生物感測器，用於超靈敏檢測PML/RARα融合基因（早幼粒細胞白血病，維甲酸受體α）。PML/RARα是染色體易位t (15; 17) (q22; q21)的產物，特異性地發生在急性早幼粒細胞白血病（APL）中。有效檢測PML /RARα可為APL患者的疾病診斷和監測提供參考。因此，將PML /RARα「S」亞型作為模型靶標DNA，使用所開發的方法實現了具有高特異性的超靈敏檢測。

用於檢測PML /RARα所提出的SPR生物感測器原理如圖1所示。首先，製備兩種類型的X形聚合物作為結構單元（圖1.A）。分別將屬於X1或X2的四條DNA鏈（S1，S2，S3和S4）退火，通過四條鏈中鹼基互補配對形成所需的X形聚合物。X形分支納米結構在5"-末端含有兩個SA適配體用於與SA結合，在3"-末端含有4條20個鹼基的突出臂，用於X1和X2之間粘性末端的雜交，以形成基於適配體的網路水凝膠納米結構。為了控制網路的精確自組裝，嚴格的雜交規則僅允許X1-S1和X2-S3，X1-S2和X2-S4，X1-S3和X2-S1，X1-S4和X2- S2之間交聯。接下來將X形聚合物用於SPR生物感測器中，主要包括四個步驟。首先，固定在晶元表面的捕獲探針（CP）與用作接頭的PML/RARα雜交，形成CP-PML /RARα雙鏈體。然後，暴露20個鹼基的RARα片段可以與X1特異性雜交，形成夾心結構。隨著X1和X2的額外引入，基於適配體的網路水凝膠納米結構通過晶元表面上兩種類型的X形聚合物交聯而形成。隨後，摻入水凝膠中的SA適配體可與SA緊密結合以進一步放大響應信號。最終，由於形成具有超分子量的複合物，SPR信號顯著增強。經優化後，每個步驟的反應時間為30min，總時長共2h，即可實現對PML/RARα的超靈敏檢測。

圖1. SPR生物感測器原理示意圖

X形聚合物中鹼基互補配對數（bp）決定其構象的穩定性，因此對形成X形聚合物的四條鏈中7-15bp的互補配對情況進行了優化。如圖1.A所示，泳道5、6具有明亮的條帶，表明經正確組裝得到互補鹼基數分別為13bp和15bp的X形聚合物。如圖1.B所示，隨著互補鹼基數增加到13bp，信噪比達到峰值並趨於穩定。因此，選擇13bp作為形成X形分支聚合物中四條鏈的最優鹼基互補配對數。

圖2. X形自組裝聚合物表徵

隨後，為確認X1、X2的有效自組裝及水凝膠納米網路的形成，進行了一系列表徵及其適用於SPR生物感測器的可行性分析。首先，通過2%瓊脂糖凝膠電泳判斷不同鏈之間雜交的反應產物。如圖3.A所示，其中泳道4和泳道5具有清晰的條帶，說明獲得了有效的雜交產物X1、X2，而泳道8中明亮的條帶說明經X1-X2雜交獲得了700-1000bp的網路水凝膠納米結構產物。進而用原子力顯微鏡（AFM）進一步表徵DNA水凝膠結構的表面形態，其平均直徑為125.2±7.5nm，平均高度為4.15±2.6nm。此外，通過SPR檢測了該生物感測器的信號放大效果。在PML/RARα存在下，通過形成CP-PML/RARα雙鏈體獲得156RU的平均響應信號ΔRU1。在引入X1後，CP-PML /RARα-X1三聯體增強了724RU（ΔRU2）。由於在晶元表面上組裝形成了網路水凝膠納米結構，ΔRU3持續增加601RU。隨後，SA與SA適配體結合將其封裝到水凝膠中以進一步放大221RU的平均響應信號ΔRU4。結果表明，該檢測方法具有顯著的信號放大作用。

圖3. SPR生物感測策略的可行性分析

隨後，該團隊利用SPR生物感測器對檢測靶標物質PML /RARα的能力以及特異性進行了分析。如圖4所示，校準曲線顯示當PML/RARα濃度從100fM升高至10nM時SPR響應信號成比例增加，其線性回歸方程為Y?=?47.47?×?lgc(fM)–74.08，相關係數為0.9981。同時，在3σ處的檢測限（LOD）估算為45.22fM。由此證明該方法具有良好的靈敏度。此外，通過檢測並比較靶標「S」亞型與其他不同亞型PML/RARα DNA的SPR反應信號以驗證該感測器的特異性。如圖5所示，在相同濃度的DNA中，「S」亞型PML/RARα DNA（曲線a）的信號是PML DNA的信號約11倍（曲線b）。RARα DNA（曲線e），「L」亞型（曲線c）和「V」亞型（曲線d）的SPR信號與空白（曲線f）沒有顯著差異。該結果表明，由於CP與具有超分子量複合物之間的選擇性交聯，該生物感測器顯示出優異的特異性。

圖4. SPR生物感測器的檢測能力

圖5. SPR生物感測器的特異性分析

該團隊還進行了實際臨床樣本的檢測，從RNA中提取PML/RARα片段，經RT-PCR擴增、變性後，利用開發的生物感測器測定以評估其潛在應用。如圖6所示，來自陽性樣品的PCR產物（泳道2）出現了條帶，同時在檢測陽性PCR產物（曲線a）時獲得了較大的SPR擴增信號，而陰性PCR產物（曲線b）僅觀察到極小的信號，表明所開發的生物感測器可以通過特異性捕獲有效識別靶標DNA。

圖6. SPR生物感測器用於臨床樣本分析

點評

1.該團隊建立了基於DNA水凝膠及包封有鏈霉親和素的SPR生物感測器，實現雙重信號放大的同時能夠保證較低的背景信號，從而實現PML/RARα融合基因的超靈敏檢測。

2.通過X形分支聚合物搭載形成的DNA網路水凝膠結構是形成純DNA水凝膠的重要方法之一，其具有穩定性、靈活性、刺激響應性等顯著特性，同時易合成及修飾，在生物感測中具有潛在的應用價值。

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Guo B, Wen B, Cheng W, et al. An enzyme-free and label-freesurface plasmon resonance biosensor for ultrasensitive detection of fusion genebased on DNA self-assembly hydrogel with streptavidin encapsulation. [J].Biosensors & Bioelectronics, 2018.

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