中科院周斌研究組利用新創建的譜系示蹤技術揭示發育過程中心臟瓣膜間充質細胞的起源及動態變化

8月15日，國際學術期刊Development在線發表了中國科學院生物化學與細胞生物學研究所周斌研究組的科研成果「Dual genetic tracing system identifies diverse and dynamic origins of cardiac valve mesenchyme」。該研究首次基於Nigri-nox同源重組構建轉基因工具小鼠，並利用基於Nigri-nox和Cre-loxP系統構建了更為精準的雙同源重組系統，具有能夠在體內同時標記並示蹤兩群獨立的幹細胞群能力，並利用此新系統揭示了心臟瓣膜間充質細胞的起源及動態變化。Nigri-nox系統與傳統的Cre-loxP系統相結合在體內的成功應用為發育、疾病和再生研究提供了更多的技術選擇。

基於位點特異性同源重組（SSR）系統的遺傳譜系示蹤技術被廣泛用於器官發育、疾病及組織再生研究。目前，多種SSR系統被普遍使用，例如Cre-loxP、Flpe-frt和Dre-rox，使用最普遍的是Cre-loxP系統，當Cre被組織特異性基因的啟動子驅動後，Cre表達並識別兩個同向的loxP位點，將兩個loxP位點之間的轉錄終止序列切除，從而使轉錄終止序列後的報告基因正常表達，由於這種切除位於基因組上，具有永久性和不可逆性，因此，所有表達過Cre的細胞群及其子代細胞（無論是否還在表達Cre）都將永久性地被報告基因蛋白所標記。基於這一特性，SSR系統被廣泛用於細胞起源和命運研究，開發出新的SSR系統也會極大地拓寬譜系示蹤技術的選擇空間。

但是生命體的發育過程及其複雜，不同組織的細胞起源及命運具有多向性和交叉性。雖然Cre-loxP系統已被普遍使用，然而Cre通常與傳統的單一報告基因（例如Rosa26-LacZ、Rosa26-tdTomato、Rosa26-GFP）結合使用，Cre被啟動子驅動後可使表達Cre的細胞表達一種相應的報告基因，即只能標記並示蹤一種細胞類型，這對於生命體複雜的發育、疾病、再生研究是遠遠不夠的。雖然前人基於不同的SSR系統已經開發了多種雙系統（或多系統）致力於體內精確的譜系示蹤研究（例如R26::FLAP, RC::Fela, R26NZG, RC::FrePe, RC::RLTG），這些系統可歸為同一類型，即適用於標記示蹤某幹細胞群及其亞群這兩種細胞類型，而並不具備標記兩類獨立的幹細胞群能力。而開發出一種新的能夠同時標記兩群獨立細胞群的譜系示蹤技術對於發育和再生醫學研究極其重要。

為了填補這一技術空白，並開發新的可以應用於體內基因編輯的SSR系統。周斌研究組的科研人員基於Nigri-nox同源重組系統構建了世界上第一隻體內受Nigri-nox系統調控的轉基因工具小鼠——Cdh5-Nigri小鼠；並將Nigri-nox系統與傳統的Cre-loxP系統結合起來，開發了一種可用於體內同時標記示蹤兩群獨立細胞群的新的譜系示蹤系統，稱之為R26-NLR（Rosa26-nox-loxP-reporter）。R26-NLR報告基因小鼠上包含兩個nox位點和兩個loxP位點以交錯形式存在（nox-loxP-Stop-nox-ZsGreen-polyA-loxP-tdToamto）, Cre同源重組酶介導loxP重組使報告基因tdTomato表達，Nigri同源重組酶介導的nox重組使報告基因ZsGreen表達，當Cre和Nigri同時被兩種獨立的細胞特異性啟動子驅動後，可實現在體內同時標記並示蹤這兩群獨立的幹細胞類群。標記何種細胞類群完全取決於Cre和Nigri序列之前的啟動子，脫離了前人開發的雙系統技術的限制。

為了進一步展示R26-NLR新系統的優勢，研究人員利用這一系統探究了在小鼠心臟發育過程中瓣膜間充質細胞的起源及動態變化。哺乳動物心臟包括四組瓣膜，包括兩組房室瓣膜（二尖瓣和三尖瓣），兩組半月瓣（主動脈瓣和肺動脈瓣）。前人的研究證明房室瓣膜間充質細胞主要來源於心臟心內膜和心臟心外膜，而半月瓣間充質細胞主要來源於心臟心內膜和神經嵴細胞。為了更方便地在同一個體觀察相應的兩群幹細胞群對瓣膜發育貢獻的動態變化。研究人員將R26-NLR系統與Tbx18-Cre小鼠（標記心臟心外膜）和Cdh5-Nigri小鼠（標記心臟心內膜）交配得到能夠同時標記心臟心外膜和心臟心內膜的Tbx18-Cre;Cdh5-Nigri;R26-NLR三基因型小鼠，通過對小鼠發育各個時間點的取樣分析，發現這兩群幹細胞對房室瓣膜的貢獻是動態變化的，E14.5之前，二尖瓣和三尖瓣的腔壁側瓣膜（與心室壁相接觸）間充質細胞主要來源於心內膜，E14.5天之後，隨著瓣膜發育，自瓣膜近端到遠端逐漸被心外膜分化來源（EPDCs）的間充質細胞所替代，這種細胞更替現象能夠一直持續到出生後P7天左右，而二尖瓣和三尖瓣的室間隔瓣膜（與室間隔相接觸）間充質細胞從瓣膜開始形成到出生後基本都來源於心臟心內膜。同時，研究人員還獲得了Wnt1-Cre;Cdh5-Nigri;R26-NLR三基因型小鼠，在體內同時標記示蹤神經嵴細胞（Wnt1-Cre）和心內膜細胞，通過對小鼠發育各個時間點取樣分析，發現半月瓣發育中間充質細胞來源的動態變化與房室瓣不同，在發育早期（E13.5左右），主動脈瓣膜間充質主要起源於神經嵴細胞，隨著瓣膜發育直到小鼠出生後，神經嵴細胞來源的比例降低，心內膜來源的比例升高，但是並不會被全部替換掉，最終保持3:2左右比例，而肺動脈瓣發育中沒有觀察到類似的動態變化，基本一直保持3:1左右比例。R26-NLR系統在體內研究的成功應用展現了其在解決多細胞起源科學問題中的應用前景，而且也為更加準確的譜系示蹤技術提供了可靠的技術思路。

該研究工作在周斌研究員的指導下，由研究生劉擴等完成，得到了香港中文大學呂愛蘭教授、美國加州大學Sylvia Evans教授等的大力支持，同時得到中國科學院、國家基金委、國家科技部、上海市科委等經費資助。

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