Science深度綜述：CRISPR/Cas指引基因工程的未來

本文轉載自「葯明康德」，由葯明康德團隊編譯整理。

CRISPR-Cas基因編輯系統的多樣性、模塊性和高效性正在掀起一場生物技術革命。RNA指導的Cas酶已經被用來作為在培養細胞，動物和植物中操縱基因組的工具。它不但加快了基礎研究的步伐，而且讓臨床和農業突破成為可能。日前，CRISPR-Cas基因編輯系統的鼻祖之一，加州大學伯克利分校的Jennifer A. Dounda博士和她課題組的Gavin J. Knott博士在《科學》雜誌上撰文，對這一技術的優勢、進化趨勢和應用進行了盤點。

Jennifer A. Dounda博士（圖片來源：加州大學伯克利官網）

01

從微生物的免疫系統到可編程的基因組編輯工具

CRISPR-Cas系統是微生物體內的一種RNA指導的適應性免疫系統。它利用RNA來引導核酸酶與特定核酸序列相結合併且將它們切斷。當病毒入侵細菌時，細菌能夠捕捉到外來遺傳物質的片段並且將它們整合到自身基因組中的CRISPR序列中。CRISPR序列轉錄生成的CRISPR RNA（crRNA）能夠與Cas核酸酶相結合，通過與靶點核酸序列進行鹼基配對為Cas核酸酶提供結合特異性。Cas核酸酶和crRNA結合之後，能夠在細菌體內起到監控病毒入侵的作用，當與crRNA匹配的遺傳片段再度出現時，Cas核酸酶能夠切斷這些遺傳片段，從而提供免疫保護作用。

CRISPR-Cas適應性免疫系統（圖片來源：《科學》）

在眾多天然CRISPR-Cas系統中，2類（class 2）系統只需要一個RNA指導的Cas核酸酶就能夠完成對靶點的切割。其中Cas9核酸酶成為了第一個被用於基因組編輯的Cas效應子。Cas9有諸多特點讓它能夠進行準確而有效的編輯。Cas9通過特異性識別crRNA和它與反式激活crRNA（tracrRNA）之間的相互作用保證Cas9隻和對應的指導RNA相結合。而crRNA和tracrRNA可以被融合成一個指導RNA（sgRNA）。最後，Cas9需要與特定PAM序列旁邊的DNA片段相結合才能觸發Cas9的雙鏈DNA切割功能。世界各地的科學家們選擇Cas9作為基因編輯工具的原因正是因為這種核酸酶的可控性和通過修改sgRNA靶點就能改變Cas9切割位點的便捷性。

雖然Cas9仍然是最常用的Cas效應子，但是科學家們已經將Cas效應子的範圍擴展到其它類型的Cas蛋白中去。CRISPR-Cas12a能夠靶向DNA序列，而CRISPR-Cas13a能夠靶向RNA。這些由RNA指導的核酸酶系統的可編程（programmability）特點是CRISPR-Cas系統能夠在精準基因組編輯以外獲得廣泛應用的關鍵。

2類CRISPR-Cas系統（圖片來源：《科學》）

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Cas媒介的基因組編輯的應用

雖然Cas的應用範圍已經得到擴展，但是精準基因組編輯仍然是CRISPR革命的前沿。Cas9和Cas12a能夠在特定位點觸發雙鏈DNA斷裂，在細胞通過非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復（HDR）對雙鏈DNA斷裂進行修復後基因組編輯就會發生。

作為精準基因組編輯工具，Cas9和Cas12a能夠在多種細胞種類和生物中起作用。它們可以用於全基因組篩選來研究基礎生物功能，或者發現和驗證複雜遺傳病的潛在藥物靶點。在臨床試驗中，Cas核酸酶可以治療由已知遺傳因素導致的疾病，例如在杜氏肌營養不良症（DMD）中，使用基因編輯可以修正基因突變或者誘發轉錄過程跳過有缺陷的外顯子。Cas9可以用於讓導致肌萎縮側索硬化症（ALS）和亨廷頓病（Huntington』s disease, HD）等神經疾病的致病基因失活。除了對體細胞進行基因編輯，這一系統還有在人類胚胎中修正基因突變的潛力，從而在人類生殖細胞中產生可遺傳的變化。

然而，值得注意的是精準編輯仍然是一個挑戰，因為NHEJ導致的修復結果可能與期待的HDR導致的修復結果競爭。另一種策略是將Cas效應子與鹼基編輯器（base editor）融合在一起。這可以限制不想要的編輯並且消除修復模板的需求。與切割DNA然後進行修復不同，切口酶Cas9（nCas9）媒介的鹼基編輯將單鹼基編輯器攜帶到指定靶點，並且在促進鹼基變換的同時不產生雙鏈DNA切割。如今Cas9媒介的單鹼基編輯器讓研究人員能夠在特定基因組位點生成任意一種鹼基變換結果。展望未來，下一代的Cas媒介的基因組編輯器很可能包括鹼基編輯器，它們的鹼基編輯活性可能通過構象變化，與Cas9媒介的靶點DNA結合偶聯在一起。

CRISPR-Cas系統的各種應用（圖片來源：《科學》）

03

使用dCas9調控轉錄過程

Cas9是一個模塊式的平台，它的DNA結合能力和核酸酶活性分屬不同的模塊。通過在Cas9核酸酶蛋白域引入突變，可以生成催化活性缺失的Cas9（dCas9）。它可以成為募集蛋白的骨架，在干擾特定位點轉錄過程時不會對DNA產生永久的影響。使用dCas9為功能性基因篩檢帶來革命性的變化，因為它讓在多種細胞中進行迅速，特異性，高通量的基因敲低成為可能。這些研究進展凸顯出在操作基因組的同時不引入永久性DNA損傷的實用性。例如，將dCas9與TET1（一種去甲基化酶）融合，可以在脆性X綜合征（fragile X syndrome）神經元和小鼠模型中靶向失調的FMR1位點，並且逆轉表型。

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使用靶向RNA的Cas在轉錄後進行基因工程

與產生永久基因變化相對，Cas效應子可以通過靶向RNA對轉錄組進行暫時干擾。利用呈現PAM序列的寡核苷酸，Cas9系統可以被改造成可編程的RNA編輯工具（RCas9）。RCas9可以用於消除致病RNA，修復mRNA剪接錯誤，或者降低三核苷酸重複序列表達的蛋白水平。目前獲得的成功表明，Cas9可能在轉錄後基因工程領域大有作為，例如與單鹼基RNA調控子融合來實現對特定RNA位點的調控。

Cas13是靶向RNA領域最新湧現的多功能工具。Cas13a系統是一個RNA指導的核糖核酸酶（RNase），它可以在哺乳動物和植物體內用於有特異性地敲低RNA。與Cas13a功能和進化相似的Cas13b具備可編程的RNase活性，它已經被用於在哺乳動物細胞中實現RNA干擾和RNA編輯。Cas9和Cas13靶向RNA的系統除了支持基礎研究以外，在臨床上可以達到和反義寡核苷酸療法相似的臨床應用，在不產生永久性遺傳變化的情況下，治療急性非孟德爾疾病（acute Mendelian patholgies)。

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可編程核酸成像

對於特定基因組位點，mRNAs，和非編碼RNAs來說，在細胞中的特定時空分布對它們的功能至關重要。將dCas9與熒光報告基因融合在一起，研究人員已經能夠對基因組中的重複位點在活細胞中進行成像。然而，限制dCas9在基因組特定位點分布研究中應用的原因是，對於非重複序列，這一手段的信噪比較低。克服信噪比不足的一個方法是在sgRNA上附加多個MS2序列，這些MS2序列能夠與MS2序列結合蛋白相結合，而將MS2序列結合蛋白與熒光蛋白融合在一起，則能夠有效地增強信號強度。使用靶向RNA的RCas9讓研究人員能夠在活細胞中追蹤RNA，從而讓追蹤攜帶重複擴增序列的RNA成為可能，這具有重要臨床意義。

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核酸檢測和診斷

在Cas13a和Cas12a中RNA指導的核酸酶活性促進了創新核酸檢測工具的研發。對於Cas13和Cas12a來說，靶點核酸通過與指導RNA的鹼基配對，會激活普通的核酸酶活性。利用這種可控的核酸酶活性，Cas13被用於從大量RNA中檢測特定RNA序列的存在。基於這一研究開發出的SHERLOCK技術平台，能夠同時檢測出登革熱和寨卡病毒的單鏈RNA的存在。

SHERLOCK系統科學論文（圖片來源：《科學》）

Cas12a有著與Cas13相似的靶向單鏈DNA的可控核酸酶活性。利用這種活性，DETECTR系統是一個基於CRISPR的DNA檢測和診斷技術平台。與等溫預擴增相結合，DETECTR系統能夠迅速準確地檢測出人乳頭瘤病毒（HPV）的臨床相關類型。

DETECTR系統科學論文（圖片來源：《科學》）

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CRISPR-Cas系統的特異性和運輸

與小分子藥物或抗體療法的脫靶效應相比，Cas核酸酶的脫靶效應尤其危險，因為它會造成基因組的永久性改變。因此，改進Cas的特異性和靶向運送尤為關鍵。研究人員已經在改進Cas酶和sgRNA設計上取得了長足進步，大幅度提高了核酸酶的特異性。而且，預測靶向結果的工具和對基因表達的時空調控為降低脫靶效應提供了全面的應對策略。

優化運送Cas系統的載體仍然是一個重大挑戰，特別是在人體可以對sgRNA和Cas產生免疫反應的情況下。在實驗室中，研究人員可以使用電穿孔、轉染、直接注射等方法將編碼Cas系統的DNA、mRNA、或RNA蛋白複合體導入細胞中。但是，其中很多種方法在臨床條件下並不適用。而且，將個體較大的Cas核酸酶與指導RNA結合形成的複合體裝進病毒載體仍然是個挑戰。解決這個問題的一個策略是利用個體較小的Cas同系物，或者對系統進行最小化，以便將它們裝進病毒載體。另外一種方法是使用納米材料完成對特定細胞種類的定向運輸。最近的研究表明，直接注射攜帶Cas9-sgRNA的納米顆粒在小鼠模型中能夠糾正DMD突變，導致臨床癥狀得到緩解。未來基於CRISPR療法的成功，很大程度上依賴於運送Cas系統載體方面的進一步研發。

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結語和未來

CRISPR-Cas技術提供了一種修改、調控和觀察基因組的便捷、而且具備很強適應性的工具。這讓它可以在廣大領域中得到生物研究和生物技術方面的應用。CRISPR-Cas工具極大地加快了科學研究的腳步，而基於Cas的生物技術的研發同樣進步迅速。多項基於Cas9的臨床試驗正在或即將進行。這些臨床試驗的結果將指引未來體細胞基因編輯在體外和患者中的應用。CRISPR-Cas9在農業方面的應用已經產生了可以進入市場的產品。CRISPR-Cas工具箱日漸擴展的應用確立了這一系統在基因組編輯，甚至是基因工程領域的前沿位置。

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