顏寧研究組報道首個人源電壓門控鈉離子通道結構

當地時間2018年9月6日，顏寧研究組在《科學》（Science）在線發表了題為《人源電壓門控鈉離子通道Nav1.4與β1複合物的結構》（Structure of the human voltage-gated sodium channel Nav1.4 in complex with β1）的研究長文，揭示了首個人源電壓門控鈉離子通道（下簡稱鈉通道）Nav1.4與它的特異性調節亞基β1複合物的冷凍電鏡結構，解析度高達3.2 埃（即0.32納米），為深入理解其作用機制及疾病相關突變的機理提供了可靠模板。

1945年，英國科學家霍奇金（Hodgkin）和赫胥黎（Huxley）第一次在槍烏賊的巨大神經元上檢測電流並首次記錄到靜息電位和動作電位；1952年，他們發現了電壓門控的鈉電流，開啟了現代生物體內電信號研究的新紀元。鈉通道負責動作電位的發生和傳播，是所有神經元和肌肉細胞上電信號的基礎。霍奇金和赫胥黎的發現為他們贏得了1963年的諾貝爾生理與醫學獎。70年代，內爾（Neher）和索克曼（Sakmann）開始用膜片鉗技術記錄單個離子通道的電流，內爾於1980年首次記錄到單個鈉通道的電流。他們因此獲得了1991年的諾貝爾生理與醫學獎。1984年，日本科學家沼田秀作（Shosaku Numa）等人第一次克隆出電鰻中的鈉通道的基因。幾十年來，包括海利（Hille）、阿姆斯特朗（Armstrong）、波澤尼拉（Bezanilla）、卡特羅（Catteral）等在內的著名科學家極大推動了鈉通道的生物物理和電生理研究。

鈉通道是由負責感受電壓和離子選擇的α亞基以及1-2個調節它的β亞基組成的。在人體中，α亞基有9種不同的亞型，分別被命名為Nav1.1-1.9，β亞基有4種亞型，分別被命名為β1-β4。α亞基一般包含大約2000個氨基酸，其中包含了四個序列相近結構類似的跨膜結構域I-IV，每個結構域含有6根跨膜螺旋。每個結構域中的前四根跨膜螺旋S1-S4構成電壓感受器(VSD)，而四組S5-S6跨膜螺旋共同構成位於整個結構中央的負責離子通透的孔道結構域，連接跨膜螺旋S5-S6之間的兩個半穿膜短螺旋共同支撐一小段伸展序列，構成負責實現離子通透特異性的選擇篩。連接第三和第四個結構域之間的序列比較短，已被證明對於鈉通道的快速失活至關重要，但具體機理並不清楚。快速失活機制可以讓鈉通道在感受刺激，引起動作電位後迅速關閉，防止神經肌肉細胞持續性放電。同時鈉鉀泵重建膜電勢，為下一次動作電位做好準備。因此鈉通道的快速失活對它發揮正常的生理功能至關重要。

鈉通道的9種亞型具有組織分布特異性，它們的異常失活或者激活與多種嚴重的神經、心血管、和肌肉系統的疾病相關，例如Nav1.1和Nav1.5各自有400多種點突變分別與癲癇和心律失常相關，Nav1.4的異常會導致肌肉僵直或高鉀血型周期性癱瘓，Nav1.7或Nav1.8的異常會造成痛覺喪失或者疼痛異常等。因此，鈉通道是重要的製藥靶點，是許多國際著名製藥公司的重點研究對象。此外，鈉通道是包括蛇毒、蠍毒、河豚毒素、蜘蛛毒素等在內的多種動物毒素的直接作用靶點。經過70多年的研究，關於人源鈉通道的工作機理的電生理學研究已經鋪天蓋地，但因為獲取哪怕微量的優質樣品都極端困難，所以人源鈉通道是結構生物學的最富挑戰性的蛋白之一。

顏寧自2007年獨立領導實驗室以來，就致力於鈉通道的結構生物學研究，於2012年報道了一類海洋菌中的鈉通道NavRh的晶體結構 (1)。但是細菌與真核生物的鈉通道具有最基本的若干區別，比如具有不同的離子選擇性，缺少快速失活機制，無法被毒素識別等等，因此不能成為研究真核鈉通道的替代蛋白。所以，顏寧過去五年一直集中力量攻堅真核鈉通道的結構與機理，終於在2017年首次報道了第一個真核鈉通道的原子模型，是來自美國蟑螂中命名為NavPaS的3.8埃解析度電鏡結構 (2)，幾個月後又報道了在鈉通道研究史中佔據重要地位的來自電鰻的鈉通道EeNav1.4的電鏡結構 (3)，並在該結構中首次看到鈉通道的α亞基與β亞基之間的相互作用。儘管這兩個結構代表了鈉通道結構與機理研究的巨大飛躍，但是這兩個通道都無法在外源表達系統中進行功能研究，從而限制它們成為模式研究蛋白。

歷經數年，顏寧教授課題組終於一步步克服了蛋白表達純化和冷凍樣品製備等多個技術瓶頸，解析了人源骨骼肌鈉通道亞型Nav1.4的高達3.2埃的電鏡結構，首次揭示了完整的電壓感受結構域、離子選擇篩、快速失活原件等關鍵功能單元的結構。在此基礎上，他們將在肌肉強直以及高鉀血型周期性癱瘓病人中發現的50多個單點突變一一對應到結構上，並且重點討論了與電壓感知和快速失活相關的突變，從而為理解致病機理提供了重要分子依據。

圖1. 人源Nav通道Nav1.4-β1的三維結構

（A）人源Nav通道Nav1.4-β1的跨膜區和胞外區結構得到很好的解析；（B）從胞外側看Nav1.4-β1有大面積的負電區域；（C）Nav1.4-β1的中央孔道從胞內側看是開放狀態；（D）計算Nav1.4-β1的中央孔道的半徑。

回首過去十多年，顏寧在清華大學領導的研究組陸續解析了原核電壓門控鈉離子通道NavRh的結構 (1)，首個高解析度的電壓門控鈣離子通道複合物Cav1.1的結構 (4, 5)，首個真核鈉通道NavPaS的結構 (2)，首個鈉通道與調控亞基的複合物結構 (3)，首個動物毒素與鈉通道複合物的結構 (6)，終於獲得首個人源鈉通道的結構。因為Nav1.4具有確定的生理功能，在此之前已經通過生物物理、電生理等各種手段在多個表達系統中廣泛研究，如今其精確結構的解析翻開了鈉通道結構與機理研究新的一頁，向完整闡釋鈉通道的工作過程邁出最重要的一步。

原清華大學生命學院、結構生物學高精尖創新中心顏寧教授是該篇研究論文的通訊作者。清華大學醫學院博士後、結構生物學高精尖創新中心卓越學者潘孝敬、CLS三年級博士生李張強、醫學院副研究員周強、醫學院博士後、結構生物學高精尖創新中心卓越學者申懷宗和藥學院肖百龍實驗室博士生吳坤為共同第一作者。國家蛋白質科學中心（北京）清華大學冷凍電鏡平台和清華大學高性能計算平台分別為該研究的數據收集和數據處理提供了支持，清華大學冷凍電鏡平台的雷建林博士對數據收集進行了指導，並獲得工作人員李曉敏的技術輔助。清華大學熊巍實驗室和龔海鵬實驗室對於電生理和分子動態模擬提供了指導和幫助。北京市結構生物學高精尖創新中心（清華）、生命科學聯合中心（清華大學）、生物膜與膜生物工程國家重點實驗室、科技部和基金委為該研究提供了經費支持。顏寧教授自2017年秋季入職普林斯頓大學分子生物學系後受到Shirley M. Tilghman講席教授專項啟動經費的支持。

相關論文鏈接：

1. X. Zhanget al., Crystal structure of an orthologue of the NaChBac voltage-gated sodium channel.Nature486, 130 (2012).

2. H. Shenet al., Structure of a eukaryotic voltage-gated sodium channel at near-atomic resolution.Science355, (2017).

3. Z. Yanet al., Structure of the Nav1.4-beta1 Complex from Electric Eel.Cell170, 470 (2017).

4. J. Wuet al., Structure of the voltage-gated calcium channel Cav1.1 complex.Science(New York, N.Y350, aad2395 (2015).

5. J. Wuet al., Structure of the voltage-gated calcium channel Cav1.1 at 3.6 A resolution.Nature537, 191 (2016).

6. H. Shenet al., Structural basis for the modulation of voltage-gated sodium channels by animal toxins.Science (New York, N.Y, (2018).

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