ACS作者智選：RNA剪接變異體的單細胞成像研究

英文原題：SpliceRCA:in SituSingle-Cell Analysis of mRNA Splicing Variants。於2018年5月30日發表於開放獲取期刊ACS Central Science。

作者：

Xiaojun Ren, Ruijie Deng, Kaixiang Zhang, Yupeng Sun, Xucong Teng, and Jinghong Li

通訊作者：

單細胞功能性RNA的分析研究是精準研究細胞功能的核心。RNA剪接是生物體基因表達的基本調控過程，是造成蛋白表達多樣性及影響生物體發育的關鍵因素。構建能夠獲取RNA剪接變異體的表達水平、空間分布及相關性等信息的單細胞分析技術是目前單細胞分析領域面臨的重要挑戰。近日，清華大學化學系李景虹課題組[1]在ACS Central Science上發表了題為「SpliceRCA: in Situ Single-Cell Analysis of mRNA Splicing Variants」的研究論文，提出了一種基於剪接拼接位點鎖環探針介導的滾環擴增技術，實現了單細胞、單分子以及單鹼基解析度的RNA剪接變異體成像方法，並利用該技術以定量方式探索了剪接變異體的差異性表達介導的免疫細胞異質性。

目前，單細胞層次分析RNA剪接變異體的技術非常有限，主要有單分子熒光原位雜交技術（smFISH）和等離子體原位雜交技術（plasmonic ISH），但其檢測鹼基解析度受到很大限制。smFISH方法由於需要同時雜交多個熒光探針，其只能檢測最小長度為600個鹼基的RNA序列，而人類外顯子的平均長度為320個鹼基；plasmonic ISH由於納米金粒子的尺寸限制也只達到300個鹼基的解析度，並且納米金粒子容易聚集以及其空間位阻易導致檢測結果不準確。因此，國際最前沿的技術仍然無法實現短外顯子的剪接變異體的檢測及單鹼基解析度分析。

李景虹課題組構建了剪接拼接位點識別耦合原位擴增反應的新技術（splice-junction anchored padlock-probe-mediated rolling circleamplification assay, SpliceRCA），顯著提高了細胞內RNA剪接變異體成像的讀取鹼基解析度。利用鎖環探針的精準定位特點，設計鎖環探針的兩個識別區域並可與剪接拼接相鄰的兩個外顯子特異性雜交。剪接反應發生使得兩個外顯子連接起來，引起鎖環探針的5』端和3』端靠近而連接成環觸發下游擴增反應（圖1A）。藉助剪接拼接位點的特異性，區分了序列相似度高的RNA剪接變異體，並使得成像方法的讀取長度可以縮短到約30個鹼基。因為鎖環探針的高特異性以及一對一（單個目標分子產生單個擴增產物）的擴增反應，SpliceRCA能夠實現單鹼基檢測精確度和實現單分子解析度下對RNA剪接變異體的分析（圖1B，C）。該技術的核酸探針設計簡單，擴增反應恆溫高效，通過不同的熒游標記擴增產物可對多種RNA剪接變異體進行分型。

圖1（A）SpliceRCA單細胞成像RNA剪接變異體的原理圖；（B，C）CD45三種剪接變異體的定量及分型；（D）RNA剪接變異體在免疫活化過程的表達水平分析；（E）細胞內RNA剪接變異體位置與細胞核和細胞外周距離統計；（F）CD45 RNA剪接變異體在免疫活化過程的相關性分析結果。

該工作實現了細胞內對短外顯子的RNA剪接變異體的原位成像分析，同時獲取了RNA剪接變異體表達水平、空間分布特徵、細胞異質性及相關性信息。並將其應用於免疫細胞活化相關基因CD45的三種關鍵剪接變異體分析（CD45RO、CD45RA和CD45RB），其可變外顯子的平均長度低於200個鹼基。該工作研究發現，三種剪接變異體亞型表達水平均發生免疫活化偏移（圖1D）。剪接變異體亞型CD45RO分布在細胞外周位置，表現出與其他兩種亞型不同。經過免疫活化後，CD45RB也傾向於表達在細胞外周位置（圖1E）。此外，我們發現CD45RO和CD45RB在細胞免疫活化過程中參與相同調控過程（圖1F，H），這是以前細胞群RNA定量方法無法所觀察到的。亞細胞水平剪接變異體亞型的空間分布特徵提供了預測和研究剪接豐富多樣性功能的新方法，從單細胞水平上分析不同剪接體亞型的表達相關性，進而揭示了具有共同調節功能的亞型，有助於闡明免疫細胞成熟過程中的調控通路。

因此，發展的SpliceRCA方法實現了細胞內RNA剪接變異體的單分子、單鹼基的原位分析，提供了一個有競爭力的單細胞功能性RNA分析平台，可用於對多種功能性RNA的同時成像分析，提供功能RNA在複雜相互作用中的新見解，在解釋細胞功能多樣性、理解免疫反應和輔助臨床監測等方面具有廣闊的前景。

本科研項目的團隊成員分別來自清華大學和北京理工大學。本科研項目得到了中國國家自然科學基金委員會和清華大學自主科研計劃的支持。

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