蛋白質修飾研究的最新篇章

蛋白質修飾的重要性

蛋白質是執行細胞功能的基本功能單元，其表達受基因組和表觀遺傳學的調控。通常，蛋白質在表達以後還需要經過不同程度的修飾才能發揮所需要的功能。這種翻譯後修飾過程受到一系列修飾酶和去修飾酶的嚴格調控，使得在某一瞬間細胞中蛋白質表現出某種穩定或動態的特定功能。蛋白質翻譯後修飾（PTM）通過共價添加官能團或蛋白質，調節亞基的蛋白水解切割或整個蛋白質的降解來增加蛋白質組的功能多樣性。

這些修飾包括磷酸化，糖基化，亞硝基化，甲基化，乙醯化，脂化和蛋白水解，並且影響正常細胞生物學和發病機理的幾乎所有方面。蛋白質磷酸化是迄今為止最常見的PTM，已在大約17，500種人類基因產物中檢測到。翻譯後修飾是增加蛋白質組多樣性的關鍵機制。儘管基因組僅包含20，000至25，000個基因，但估計蛋白質組包含超過100萬個蛋白質。轉錄和mRNA水平的變化增加了轉錄組相對於基因組的大小，並且無數的不同翻譯後修飾指數增加了蛋白質組相對於轉錄組和基因組的複雜性。因此，識別和理解PTM對細胞生物學和疾病治療和預防的研究至關重要。

（蛋白修飾3d示意圖）

蛋白質修飾研究進展

基於翻譯後修飾蛋白質的不均一性及相對丰度低的特性，翻譯後修飾蛋白質的研究主要是利用現有的蛋白質組學技術體系包括電泳、色譜、生物質譜以及生物信息學工具，對修飾蛋白質或肽段進行富集分離，消除修飾引起的不均一性並標記修飾位點，使之與理論質 量有一個差異，通過質譜檢測這種差異，從而鑒定蛋白質，並通過串聯質譜鑒定修飾位點。PTMs 廣泛存在於真核細胞生物中，對生物體的信號傳導以及生命活動至關重要，但是 PTMs 鑒定往往比未修飾多肽 鑒定更加困難。

蛋白磷酸化修飾是生物體內最為普遍也是研究最為深入的修飾方式，而其中的酪氨酸磷酸化，特別是酪氨酸激酶受體的磷酸化已經被證明對癌細胞的誘發和生長有關鍵作用，多種針對不同酪氨酸激酶受體的小分子抑製劑和單克隆抗體也已經被開發成為治療癌症的一線藥物。目前研究較多的蛋白翻譯後修飾包括磷酸化、乙醯化、甲基化和泛素化四類修飾。

（基本修飾類型）

磷酸化的研究方法及關鍵技術有：免疫沉澱法、流式細胞分析、雙向凝膠電泳法、固相金屬親和色譜等。針對乙醯化主要的研究方法有：生物質譜鑒定乙醯化修飾位點、基於特異性識別乙醯化賴氨酸殘基的乙醯化抗體鑒定乙醯化修飾位點、以標記底物為基礎的方法鑒定乙醯化修飾位點等。針對甲基化主要的研究方法有：甲基化特異性的 PCR、亞硫酸氫鹽測序法、高解析度熔解曲線法。

而糖基化的研究方法及關鍵技術有：放射性標記法、分子熒游標記法、電泳法、凝集素標記法、抗體標記法、化學酵素法等。目前所具有的對泛素蛋白探究的技術類型比較單調。對泛素蛋白的檢測、泛素作用靶點的定位以及泛素蛋白本身性質的探究方法中，這些技術還必須進行不斷的改進和完善。譬如，傳統的蛋白質翻譯後修飾研究主要依賴於基於特異性抗體的免疫檢測技術或放射性標記技術。這些方法對研究由單一位點翻譯後修飾介導的細胞信號轉導過程起著不可替代的作用。然而，由於上述技術存在操作要求高、特異性抗體製備周期長等缺點，很難實現蛋白質翻譯後修飾的大規模檢測。

蛋白質修飾檢測技術進展

近年來，基於液相色譜與生物質譜聯用技術( LC-MS) 的蛋白質組學策略發展迅速，為系統水平上的蛋白質翻譯後修飾研究提供了強有力的研究工具。且基於質譜的蛋白質組學大大擴展了人們對蛋白質翻譯後修飾（PTM）的發生和動態的了解。到目前為止，定量蛋白質組學主要用於研究細胞培養模型中的PTM調控，為異常PTM模式在人類疾病中的作用提供新的見解。質譜庫已被廣泛應用於準確研究各種蛋白質定量分析，在定量已知蛋白質的應用研究中尤為突出。

（儀器設備）

目前，利用單克隆基序抗體對含有PTM肽段進行免疫親和富集並聯合液相色譜-質譜(LC-MS/MS)分析的PTMScan新技術策略在多種翻譯後修飾研究中引起了關注。PTMScan技術的基本操作方法包括利用9M 尿素裂解液，對疾病細胞系或患者組織塊(足夠提 取10 mg蛋白)進行裂解獲取蛋白裂解物，經過蛋白內切酶(通常使用胰酶)消化後獲得蛋白肽段混合物，利用C18純化柱對肽段混合物進行純化，然後利用CST公司獨有的蛋白質翻譯後修飾motif抗體分別對含有不同蛋白後修飾的肽段進行親和富集並純化，利用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)進行半定量分析。

此外生物信息學的分析方法也在PTM研究領域取得進展，近年來，隨著蛋白質組學技術的發展，基於蛋白質組尤其是修飾蛋白質組學數據的生物信息學研究可以對翻譯後修飾提供整體和更深層次的認識。1999 年，丹麥生物序列分析中心(Center for Biological Sequence Analysis， CBS)的 Nikolaj Blom等使用當時已知的、實驗證實的 210 個酪氨酸 (Tyrosine)、584個絲氨酸(Serine)和108 個蘇氨酸 (Threonine)磷酸化位點作為訓練集，利用神經網路 (Neural network) 演算法首次實現了非特異性的 (Non-specific)蛋白質磷酸化位點的預測。此後類似實驗逐漸開展，陸續研究逐漸問世。國外一項比較小鼠正常皮膚與皮膚癌組織的工作中，結合定量蛋白質組與定量磷酸化組數據，通過比較發現 47.3%的蛋白質在蛋白和磷酸化水平都受到調控，而超過一半的蛋白質僅在磷酸化水平受到調控。可以預見計算與實驗合作， 通過實驗學的方法驗證或至少部分驗證預測結果，已成為領域的研究趨勢。

（生物信息學解碼蛋白修飾）

生物谷將於2018年10月26至27日，在上海舉辦2018蛋白質修飾與疾病研討會。此次會議將邀請該領域的國內專家，圍繞蛋白質修飾的種類方式、作用機制，與疾病及藥物研發的關係等，從不同角度和層面呈現蛋白質修飾的基礎研究、調控方法、檢測手段、分析技術等最新進展，為與會者提供一個前沿的交流平台，促進基礎研究向實際應用轉化。歡迎大家過來與會交流。

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