人體喉部的功能性組織解剖學 23-12：組織幹細胞與人聲帶黏膜的幹細胞龕

概要

1.最新研究表明，人體黃斑中的聲帶星狀細胞參與細胞外基質的代謝，這對於人聲帶粘膜的粘彈性是必需的。另外，聲帶星狀細胞被認為是人類聲帶粘膜的生長，發育和衰老中的重要間質細胞。

2.聲帶狀星狀細胞被認為是人類聲帶中的一類新細胞。尚不確定聲帶星狀細胞是否來自與成纖維細胞相同的胚胎來源。

3.越來越多的證據表明，包括斑點狀黃斑中的聲帶星狀細胞的細胞是人類聲帶的組織幹細胞，而斑塊狀黃斑是幹細胞生態位的候選者。

4.包括人成體斑塊中的聲帶星狀細胞的細胞具有所有三個胚層的蛋白質。這表明細胞是未分化的並且具有多能性。

5.斑塊狀黃斑中細胞的放射敏感性很高，表明細胞尚未像成纖維細胞那樣完全分化。

6.端粒酶位於斑塊狀黃斑中的細胞中。它們是靜止細胞（G0期）。

7.人類成年斑黃斑中的細胞分裂反映了不對稱的自我更新，培養的細胞形成集落形成單位。因此，該現象導致人黃斑中的細胞很可能是組織幹細胞。

8.最近的研究表明，人體黃斑中的細胞不是來自聲帶粘膜的常駐間質細胞，而是來自骨髓細胞通過外周循環的分化。

9.出生時，細胞已經從骨髓供應到新生兒聲帶中的黃斑中，並準備開始作為振動組織的人聲帶粘膜的生長和發育。

10.黃斑中的乙醯透明質酸濃度很高，並含有具有透明質酸受體的細胞，表明斑黃疣是富含透明質酸的基質，這是幹細胞生態位所必需的。

11.在人類聲帶粘膜的斑塊狀黃斑中適當的微環境必須有效地作為保持所含組織幹細胞的乾性的幹細胞生態位。

12.1簡介

幹細胞是細胞的一個子集，具有通過自我更新補充自身的獨特能力以及分化成不同類型的成熟細胞的潛力。因此，這些特徵在胚胎髮育和組織再生期間的器官發生中起重要作用。幹細胞有兩種主要類型：胚胎和成體。隨著發育的進行，出現了器官發生的需要，並且胚胎形成用於生殖的種系幹細胞和用於器官發生的體幹細胞。

出生後，成體幹細胞（包括種系幹細胞和體幹細胞）存在於稱為「生態位」的特定微環境中，其根據組織類型在性質和位置上變化。這些成體幹細胞是組織穩態的重要組成部分;它們支持正在進行的組織再生，取代由於天然細胞死亡（細胞凋亡）或損傷而損失的細胞。

在另一種分類系統中，幹細胞根據它們分化的潛力分為兩個主要組，多能和多能。多能（胚胎）幹細胞可以分化成體內的各種細胞，而多能（成人）幹細胞可以分化成多個但不是全部的細胞譜系。

成體組織特異性幹細胞（組織幹細胞，體幹細胞）具有自我更新和產生功能分化細胞的能力，這些細胞補充在整個生物體的整個生命過程中丟失的細胞。組織特異性幹細胞存在於生態位中，由此複雜的微環境維持其多能性。

在我們的實驗室於2001年發現了在人類黃斑中具有星形外觀的間質細胞。這些細胞具有脂滴並儲存維生素A.它們與人類聲帶粘膜中的成纖維細胞有許多形態學差異，並且不斷合成對於人聲帶粘膜的粘彈性必不可少的細胞外基質。這些細胞沒有命名法，因此在我們之前的一系列研究中被指定為聲帶星狀細胞。

最新研究證實，人體黃斑中的聲帶星狀細胞參與細胞外基質的代謝，這對於人類聲帶粘膜的粘彈性特性是必不可少的。聲帶星狀細胞被認為是人類聲帶中的一類新細胞，並且被認為是人類聲帶粘膜的生長，發育和衰老中的重要間質細胞。

我們的另一項研究顯示，人類斑塊狀黃斑中的聲帶星狀細胞是具有核周維生素A液滴的結蛋白陽性細胞，並顯示出所提出的「瀰漫星狀細胞系統」中包含的細胞的形態特徵。

尚不確定聲帶星狀細胞是否來自與人聲帶粘膜中的成纖維細胞相同的胚胎來源。

作為最新研究的結果，有越來越多的證據表明，人類黃斑病中包括聲帶星狀細胞的細胞是人類聲帶粘膜中的成人多能幹細胞，組織幹細胞或祖細胞。 黃斑是幹細胞生態位的候選者，這是一種培養幹細胞庫的微環境。

關於如何調節人體黃斑中包含的這些細胞的研究是具有挑戰性的，但在人類聲帶的再生醫學領域中是重要的。

不僅對細胞而且對其微環境的操縱是再生醫學的策略之一。使用尖端方法（例如，通過化學生物學）對這些細胞進行人工操作可以導致聲帶再生的高級發展。了解負責細胞微環境調節的機制，包括人類黃斑中的聲帶星狀細胞，將提供通過其微環境操縱細胞所需的工具，用於開發治療疾病和組織損傷的方法。轉化醫學的重點是如何調節細胞和聲帶黃斑中包含的細胞外基質（微環境）將有助於我們恢復和再生人類聲帶組織的能力。

12.2人類成年黃萎病菌中細胞的中間絲

蛋白質在細胞質的中間絲中的表達對細胞類型和分化是特異性的。由於中間絲的組織特異性，可以基於存在的中間絲蛋白區分來自不同組織的細胞。

微絲分布在人體黃斑中的細胞的細胞質中，並且還存在10nm厚的細絲（中間細絲）（圖12.1）。

中間絲中的蛋白質包括細胞角蛋白（圖12.2a），波形蛋白（圖12.2b），膠質纖維酸性蛋白（GFAP）（圖12.2c）和結蛋白（圖12.2d）分布在細胞質中。細胞包括成年斑黃斑中的聲帶星狀細胞。細胞角蛋白是上皮細胞的中間絲的蛋白質，波形蛋白是間充質細胞的中間絲的主要亞基蛋白。膠原纖維酸性蛋白，中間絲蛋白家族的成員和神經嵴細胞的特徵，在星形膠質細胞和中樞神經系統中的某些其他星形膠質細胞中大量且特異性地表達。此外，神經幹細胞經常和強烈表達神經膠質原纖維酸性蛋白。結蛋白是中間絲的蛋白質，是肌原性嵴細胞的特徵，存在於肌細胞中。

圖. 12.1 人體黃斑中細胞的細胞質中的微絲（中間細絲）的透射電子顯微照片（乙酸鈾醯和檸檬酸鉛染色）

另外，人黃斑中的細胞表達SOX17（圖12.3），其是內胚層細胞標記物。

因此，人成體黃斑中的細胞表達所有三個胚層的蛋白質。 這表明它們是未分化的細胞並具有多能性。

尚不確定人類成人黃斑中的細胞是否來自與人類聲帶中的成纖維細胞相同的胚胎來源。

圖. 12.2 人類黃斑中細胞的免疫組織化學染色。 （a）細胞角蛋白，（b）波形蛋白，（c）膠質纖維酸性蛋白，（d）結蛋白

12.5成年人黃斑細胞的細胞周期

定義為Ki-67的抗原是人核蛋白，其表達與細胞增殖密切相關，並且在常規病理學中廣泛用作測量細胞生長分數的增殖標記[16]。 細胞在細胞周期中增殖期間表達Ki-67（G1-，S-，G2-，M-期），但處於停滯狀態（G0期）的細胞不表達Ki-67。

包括斑塊狀黃斑中的聲帶星狀細胞的細胞不表達Ki-67（圖12.5），表明它們是靜息細胞（G0-相），幹細胞也是如此。

圖. 12.3 通過免疫組織化學染色顯示，在人黃斑中的細胞中檢測到SOX17

12.3人類成年黃萎病菌中細胞的放射敏感性

包括星形黃斑中的聲帶星狀細胞在內的細胞的放射敏感性在形態學上高於人聲帶粘膜的Reinke空間中的成纖維細胞（第11章），表明細胞尚未像成纖維細胞那樣完全分化。

12.4人類成年黃萎病菌中細胞的端粒酶

稱為端粒酶的特殊DNA聚合酶可以催化端粒重複序列的額外拷貝的形成，從而補償DNA複製過程中染色體兩端發生的逐漸縮短。在多細胞生物中，端粒酶主要存在於產生精子和卵子的生殖細胞中，以及一些其他種類的增殖正常細胞如幹細胞中。由於在大多數細胞中未發現端粒酶，因此每個細胞分裂時其染色體端粒越來越短。端粒酶的存在允許細胞無限分裂而不會發生端粒縮短。

包括斑點狀黃斑中的聲帶星狀細胞的細胞表達端粒酶逆轉錄酶（圖12.4），表明稱為端粒酶的特殊DNA聚合酶存在於黃斑中的細胞中。這進一步表明人類黃斑中的細胞是人聲帶粘膜中的組織幹細胞。

圖. 12.4 通過免疫組織化學染色顯示在人黃斑病毒細胞中的細胞中檢測到端粒酶逆轉錄酶

圖. 12.5 人體黃斑中的細胞不表達Ki-67（免疫組織化學染色）

12.6人類成年黃萎病菌與周圍組織之間的過渡區

斑點狀黃斑與其周圍組織之間的過渡區域很有趣。

後黃斑附著於杓狀軟骨的聲音過程後方。位於聲音過程尖端的彈性軟骨有助於在內收和外展過程中發聲過程。黃斑後黃斑和聲帶過程的彈性軟骨部分之間的細胞和細胞外基質的轉變是漸進的，並且它們之間的邊界沒有清楚地描繪（圖12.6）。後黃斑中的細胞似乎在聲音過程的尖端分化成軟骨細胞。

人黃斑中的細胞表達CD44（間充質幹細胞標記物）。斑塊狀黃斑周圍組織中的大多數成纖維細胞不表達CD44。然而，在斑塊黃斑的外圍觀察到CD44陽性成纖維細胞（圖12.7）。黃斑黃斑中的細胞似乎分化成周圍組織中的成纖維細胞。

這些發現提高了包括斑塊狀黃斑中的聲帶星狀細胞的細胞產生功能分化細胞的可能性，例如人聲帶粘膜中的軟骨細胞和成纖維細胞。需要進一步研究以確定包括斑塊狀黃斑中的聲帶星狀細胞的細胞是否具有自我更新的能力併產生功能分化的細胞（多能性），其在整個生物體的整個壽命期間補充丟失的細胞。

12.7人黃斑中細胞的細胞分裂

人體黃斑的體外培養產生了有趣的結果。

在顯微鏡下從手術標本中提取人聲帶粘膜的黃斑後，將黃斑黃斑在培養基中切碎，培養和增殖。

圖. 12.6 人成人後黃斑黃斑與杓狀軟骨發聲尖端之間的過渡區域。 （a）後黃斑和聲帶過程的尖端。 （b）後黃斑和聲帶尖端之間的過渡。 （c）黃斑後部黃斑。 （d）聲音過程的彈性軟骨部分

圖. 12.7 人類成人後部黃斑黃斑和周圍組織之間的邊界（CD44，免疫組織化學染色）。清楚地描繪了包含聲帶星狀細胞和周圍組織的密集質量黃斑黃斑之間的邊界（星號）。在人黃斑的外周觀察到CD44陽性成纖維細胞

在MF-start原代培養基（Toyobo，Osaka，Japan）中進行了幾周的原代培養後，兩種類型的細胞，成纖維細胞樣梭形細胞（A組）和鵝卵石狀 - 如鱗狀細胞（B組），生長從黃斑黃斑片段（圖12.8）。鵝卵石狀鱗狀細胞呈多邊形，具有橢圓形核（圖12.8c）。細胞核 - 細胞質比率高。

在通過細胞刮刀除去兩種類型的細胞後，將每種類型的細胞單獨傳代培養在MF-培養基（間充質幹細胞生長培養基）（Toyobo，Osaka，Japan）中以增殖細胞。

在第一次傳代培養一周後，傳代培養的A組細胞變成星狀並具有細長的細胞質過程（圖12.9a）。細胞質中存在小的脂滴。細胞核呈橢圓形，核 - 細胞質比例低。這些細胞在形態上與聲帶星狀細胞相似。

在第二次傳代培養一周後，傳代培養的B組細胞形成集落形成單位（圖12.9b），表明這些細胞是骨髓中的間充質幹細胞或基質幹細胞。

菌落形成是幹細胞的特徵之一。 Friedenstein等人首先描述了體外集落形成單位。他們確定，可以從骨髓基質中分離出形成細胞集落的體外培養的貼壁成纖維細胞。該菌落形成單位可以分化成軟骨，骨骼和脂肪組織。在胚胎幹細胞（ES細胞），誘導的多能幹細胞（iPS細胞）和諸如肝幹細胞和腎祖細胞的組織幹細胞或祖細胞中也觀察到這樣的集落。因此，集落形成現象使得人類斑塊狀黃斑中的細胞（包括聲帶星狀細胞）成為組織幹細胞的可能性。

圖. 12.8 用MF-start原代培養基（Toyobo，Osaka，Japan）進行黃斑黃斑的原代培養（相差顯微鏡）。 （a）兩種類型的細胞，鵝卵石樣鱗狀細胞和成纖維細胞樣梭形細胞，從原代培養物中的黃斑黃斑片段生長。 （b）成纖維細胞樣梭形細胞。 （c）鵝卵石狀鱗狀細胞

如上所述，具有間充質幹細胞生長培養基的人成體黃斑中的細胞分裂反映了不對稱的自我更新（圖12.10）。幹細胞生態位中的不對稱性是指子細胞彼此不同的概念。有大量證據表明，許多幹細胞分裂導致一個子細胞與親本細胞相似，因此，必然允許幹細胞表型的自我更新，而另一個子細胞是分化的或承諾的細胞。類型。細胞分裂中的不對稱性導致人成體聲帶中的斑點狀黃斑是包含組織幹細胞的幹細胞小生境的可能性。

圖. 12.9 在MF-培養基（間充質幹細胞生長培養基）（Toyobo，Osaka，Japan）中對每種細胞進行單獨傳代培養以增殖細胞（相差顯微鏡）。 （a）星狀細胞。原代培養物中的成纖維細胞樣細胞在形狀上變成星狀細胞，並且在傳代培養中具有細長的細胞質過程和細胞質中的小脂滴。 （b）菌落形成單位。 MF培養基中的鵝卵石狀鱗狀細胞形成菌落形成單位

12.8人類黃斑中組織幹細胞的層次結構

這裡出現的問題是，聲帶星狀細胞是組織幹細胞還是祖細胞（轉運擴增細胞）。

集落形成的傳代培養細胞（鵝卵石樣鱗狀細胞）（圖12.11）和非集落形成的亞培養細胞（成纖維細胞樣梭形細胞）（圖12.12）表達細胞質細胞角蛋白（上皮相關蛋白），波形蛋白（間充質細胞相關蛋白），膠質纖維酸性蛋白（GFAP）（神經相關蛋白）和結蛋白（肌肉相關蛋白）。因此，集落形成細胞（鵝卵石樣鱗狀細胞）和非集落形成細胞（成纖維細胞樣梭形細胞）均表達外胚層和中胚層胚層。這表明它們是未分化的細胞並具有多能性。

聲帶星狀細胞可能是轉運 - 擴增細胞，即祖細胞。然而，在目前的研究狀態下，很難澄清幹細胞系統和人類黃斑中的幹細胞層次，並確定聲帶星狀細胞是組織幹細胞還是祖細胞。

12.9 黃斑的微環境作為人類聲帶摺疊中的幹細胞生態位

12.9.1富含透明質酸的基質

賦予多細胞生物細胞乾性的結構和生物化學微環境被稱為幹細胞生態位。幹細胞生態位由特定組織位置的一組細胞組成，用於維持幹細胞。

透明質酸作為眾多幹細胞群的重要利基成分。透明質酸發現後，人們認為其主要功能是組織的生物物理和穩態特性。然而，目前的研究使人們認識到透明質酸在細胞行為中也起著至關重要的作用。富含乙醯透明質酸的基質由糖胺 - 神經糖醇透明質酸及其跨膜受體（細胞表面透明質酸受體）組成，能夠直接影響幹細胞生態位中幹細胞的細胞功能。

人類成人聲帶中的斑點黃斑在pH 2.5下用阿爾新藍強烈染成淺藍色（圖12.13），並且注意到在pH 1.0下用阿爾新藍染色相對稀疏。包括聲帶星狀細胞在內的細胞周圍的基質物質以相同的方式染色。用透明質酸酶消化用Alcian Blue（pH 2.5）強烈染色的黃斑黃斑中的材料。大量的糖胺聚糖（透明質酸）位於細胞周圍，並且人類成年斑中的透明質酸濃度很高。清晰地描繪了密集的透明質酸（黃斑黃斑）和周圍組織之間的邊界（圖12.13b）。此外，大多數細胞包括斑塊狀黃斑中的聲帶星狀細胞表達CD44（細胞表面透明質酸受體）

圖. 12.10 用MF培養基對斑塊中的細胞進行不對稱細胞分裂。 人體黃斑中的細胞分裂反映了不對稱的自我更新。 一種類型的細胞是組織幹細胞（聲帶幹細胞），其形成集落形成單位。 另一種類型是轉運 - 擴增細胞（祖細胞），其形狀為星狀，與聲帶星狀細胞相似

圖. 12.11 集落形成細胞（鵝卵石樣鱗狀細胞）的免疫組織化學

圖. 12.12 非集落形成細胞（成纖維細胞樣梭形細胞）的免疫組織化學

(圖. 12.14). 這表明人體黃斑是富含透明質酸的細胞周圍基質。

由於人體黃斑中包含聲帶星狀細胞的細胞具有細胞表面透明質酸受體並且被高濃度的透明質酸包圍，所以斑塊狀黃斑是幹細胞生態位的候選者，這是一種培養組織幹細胞庫的微環境，包括聲帶星狀細胞。

12.9.2 黃斑中的適當微環境作為幹細胞生態位

另一方面，用Dulbecco改良的Eagle培養基（DMEM）（Nissui，Tokyo，Japan）培養的斑塊狀細胞代替間充質幹細胞生長培養基，其形狀為星狀，並具有細長的細胞質過程（圖12.15）。鵝卵石樣鱗狀細胞不會出現。星狀細胞的細胞核呈橢圓形，細胞核質比低。在原代培養物中，細胞質中存在小的脂滴;然而，這些在第二種文化中消失了。星狀細胞通過將它們的細胞質過程相互連接而增殖（圖12.15）。這些細胞在形態學上類似於聲帶星狀細胞。在傳代培養期間，每個細胞繼續表現出相同的形態特徵。

圖. 12.13 （a）人類成人黃斑（阿爾新藍染色，pH 2.5）。 大量透明質酸（糖胺聚糖）（淡藍色染色材料）位於黃斑細胞周圍，並且人成年黃斑中的透明質酸濃度高。 （b）人類成人黃斑黃斑與周圍組織之間的邊界（阿爾新藍染色，pH 2.5）。 包含透明質酸和周圍組織的黃斑密集質量之間的邊界（星號）清晰劃定

圖. 12.14 通過免疫組織化學染色顯示CD44在細胞的細胞質上，包括人黃斑中的聲帶星狀細胞

圖. 12.15 用Dulbecco改良的Eagle培養基進行黃斑黃斑的原代培養。 星狀細胞從黃斑片段生長

圖. 12.16 用Dulbecco改良的Eagle"s星狀細胞培養基進行對稱細胞分裂。在傳代培養期間，每個細胞繼續呈現星狀形狀

這些現象表明，用Dulbecco"s改良Eagle"s培養基對人體黃斑進行細胞分裂反映了對稱的自我更新（圖12.16）。相反，具有間充質幹細胞生長培養基的人類黃斑中的細胞分裂反映了不對稱的自我更新（圖12.10）。人聲帶粘膜的斑塊狀黃斑中的適當微環境對於保持所含組織幹細胞的乾性的幹細胞生態位是有效的。

12.10人類黃斑病菌中細胞的來源

骨髓來源的細胞在組織發育和再生方面受到了極大的關注。骨髓來源的細胞含有骨髓來源的間充質幹細胞，其是能夠自我更新的多能細胞，並且被認為是循環纖維細胞的起源，其與傷口癒合和組織纖維化相關。它們在外周血液中循環，在正常條件下分布到器官。當組織受損時，它們通過細胞分化促進組織修復並根據需要遷移到受損組織中。

Bucala等人首先將循環纖維細胞描述為血源性成纖維細胞樣細胞。發現它們是獨特的細胞，因為它們共表達造血標記物以及I型膠原蛋白和其他間充質標記物。 CD34（造血幹細胞標記物），CD45（白細胞共同抗原）和I型膠原是循環來自骨髓的纖維細胞的主要標記物。

圖. 12.17 人類黃斑中細胞的免疫組織化學染色。 （a）在細胞中檢測到CD34。 （b）黃斑含有CD34陽性細胞。 （c）人成人後黃斑與周圍組織之間的邊界（CD34，免疫組織化學染色）。 清楚地描繪了包含聲帶星狀細胞和周圍組織的密集質量的黃斑黃斑之間的邊界（星號）。 在人類黃斑前外側觀察到CD34陽性成纖維細胞

圖. 12.18 通過免疫組織化學染色顯示在人黃斑中的細胞中檢測到CD45

圖. 12.19 通過免疫組織化學染色顯示I型膠原蛋白在人體黃斑中的細胞和基質中檢測到

包括人黃斑中的聲帶星狀細胞的細胞表達CD34（造血幹細胞標記物）（圖12.17）。它們還表達CD45（白細胞共同抗原）（圖12.18）和I型膠原（圖12.19）。這些蛋白質（CD34，CD45和I型膠原蛋白）是骨髓來源的循環纖維細胞的主要標誌物，存在於人體黃斑中的細胞中。

因此，人體黃斑中包括聲帶星狀細胞的細胞很可能不是來自聲帶粘膜的駐留間質細胞，而是來自骨髓細胞通過外周循環的分化。

12.11聲帶粘膜中的側群細胞

側群細胞被認為是富含幹細胞或祖細胞的細胞群，並被認為是組織幹細胞的候選者。

在最近的一項研究中，在上皮和上皮下組織中鑒定出側群細胞，包括前部和後部黃斑。在最近的另一項研究中，側面人群細胞在第3天開始的受傷聲帶的Reinke空間中顯著增加，在第7天達到峰值，然後在第14天降低回到基線值。斑黃疣中的這些細胞參與傷口癒合的早期階段。

這裡引用的兩項研究表明，前部和後部黃斑病病毒包含幹細胞或促細胞，這些細胞具有在組織再生中發揮重要作用的能力。另一方面，有報道提出聲帶成纖維細胞是位於聲帶粘膜中的間充質幹細胞。

12.12聲帶摺疊幹細胞及其在人類新生兒聲帶粘膜中的生態位

新生兒在與成人聲帶相同的位置處具有斑點狀黃斑。新生斑點狀黃斑由相對密集的細胞團組成，位於雙側聲帶粘膜的前端和後端。新生兒黃斑中的細胞具有間充質細胞的一些特徵。包括人新生斑黃斑中的聲帶星狀細胞的細胞具有所有三個胚層的蛋白質。它們很可能是未分化的細胞，其不是來自常駐間質細胞而是來自骨髓細胞的分化。我們的研究結果與包括聲帶星狀細胞的細胞是人類新生兒聲帶粘膜的組織幹細胞或祖細胞的假設一致。

人類新生兒聲帶中的黃斑黃斑僅在pH 2.5下用阿爾新藍輕微染成淡藍色，並且新生斑黃疣中CD44陽性細胞的百分比不是很大。新生兒的黃斑黃斑正在獲得透明質酸基質，使其成為幹細胞生態位的候選者。

出生時，細胞已經可能從骨髓中提供到新生的聲帶中的黃斑中，並準備開始人類聲帶粘膜的生長和發育，作為振動組織。

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