Crystal 數字PCR技術精準檢測HER-2基因拷貝數
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乳腺癌是女性排名第一位的常見惡性腫瘤。據2016年國家癌症中心統計顯示，全國新髮乳腺癌病例數達27.24萬，每年死亡率超過7萬。其中15%-25%的乳腺癌患者顯示為HER-2基因過表達。
HER-2/neu（又稱c-erbB-2）基因為表皮生長因子受體家族成員之一，是一種原癌基因，研究表明，HER-2/neu基因擴增或過表達的乳腺癌患者易早期複發且生存期縮短。
檢測HER-2基因是否高表達對於患者的預後判斷、治療方案的選擇具有重要意義,HER-2是乳腺癌明確的預後指標和藥物治療效果的預測指標。
三色熒光通道Crystal微滴晶元數字PCR檢測HER-2拷貝數擴增
HER-2的擴增情況是乳腺癌中靶向治療中至關重要的指標，但是評估HER-2拷貝數變異時，腫瘤DNA被來源於健康細胞的DNA中稀釋，所以在檢測時非常具有挑戰性。
Crystal 數字PCR技術為提高HER-2拷貝數變異檢測的準確性提供了很好的解決方案。Crystal數字PCR採用創新的微滴化技術，將含有DNA或RNA的PCR反應體系分成約20,000-30,000個微滴。
經PCR擴增後，逐個對每個微反應進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例即可得出靶分子的起始拷貝數或濃度。
接下來我們介紹Crystal微滴晶元數字PCR如何可靠地識別腫瘤微小病灶樣本中的HER-2擴增情況？
我們將之前報道的Assay在Crystal數字PCR平台進行優化，檢測17號染色體上的HER-2（ERBB2）和MRMM1，以及2號染色體上的TSN（內參基因）［1］。這種檢測方法能夠絕對定量HER-2拷貝數，並區分HER-2擴增和17號染色體多倍體，避免HER-2擴增情況被錯誤評估。
HER-2擴增檢測的靈敏度
從SKBR3細胞株(HER2/TSN比例為10:1)中提取的基因組DNA，摻入正常基因組DNA中達到從1%到12%的突變頻率，建立HER-2/TSN比值從1～2.2的模型。
使用泊松公式計算TSN和HER-2的絕對濃度，並應用Z-檢驗對log HER2 / TSN比值（呈近似正態分布）表徵突變DNA量進行顯著性檢驗（α=β= 5％）［2］。通過這種方法，我們能夠顯著地檢測突變DNA的存在，靈敏度可達2%，對應HER-2/TSN比值為1.2。
圖1.不同HER-2 / TSN比值的樣本檢測（*α=β= 5％，具有統計學意義）。 總DNA濃度為2.5ng /反應（760cp /μL）。樣本利用限制性內切酶片段化後在Crystal數字PCR平台進行檢測三重實驗。
乳腺癌患者樣本中HER-2擴增和17號染色體多倍體的檢測
目前腫瘤樣品中HER-2擴增的方法依賴於免疫組織化學(IHC)來評估HER-2過表達，對於IHC不明確的結果HER-2表達(IHC2+)，需要通過熒光原位雜交(FISH)檢測HER-2基因擴增進行檢測。兩種方法均操作繁複，且需要高度專業的知識進行後續分析。分子生物學方法是更簡單、更快速、更公正的替代法。
本研究使用法國Gustave Roussy研究所提供的7例乳腺癌患者樣本中提取的DNA進行檢測，並將Crystal數字PCR獲得的結果與標準診斷程序獲得的結果進行比較。
圖2，使用標準診斷程序(IHC和FISH)(A)和通過Crystal數字PCR(B)對患者1-7進行HER-2擴增評級。
用IHC/FISH和Crystal 數字PCR對1-4號患者樣本（兩種方法均認為HER2擴增為陽性）和來自6號和7號患者樣本（HER-2擴增為陰性）所得結果一致。Crystal 數字PCR同時檢測出了6號患者的染色體17號染色體多倍體情況。
但是標準診斷程序檢測到了5號患者樣本中HER-2的擴增，Crystal數字PCR檢測出由於17號染色體多體性而導致的HER-2信號升高。
與其他數字PCR平台的比較
利用獨立開發HER-2基因檢測Assay，通過16個乳腺癌患者樣本的檢測與IHC方法和不同數字PCR技術進行比較，Crystal 數字PCR技術檢測HER-2的方法靈敏度達75%，特異性達92%，與IHC標準方法結果一致，與其他數字PCR技術相比，靈敏度更高［3］。
同時能夠克服細胞學方法所涉及的異質性問題，操作更為簡單，成本較傳統方法下降75%。
圖3：16位乳腺癌患者不同數字PCR技術比較結果
參考文獻：
[1] Jacquemier et al. 「SISH/CISH or qPCR as alternative techniques to FISH for determination of HER2 amplification status on breast tumors core needle biopsies: a multicenter experience based on 840 cases」. BMC Cancer. 2013；13:351. PMID: 23875536
[2] Whale et al. 「Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation」. Nucleic Acids Res. 2012；40:11. PMID: 22373922§ Courtesy of Dr Cécile Jovelet, Translational Research Laboratory, Institut Gustave Roussy, France
[3]第五屆微流控晶元高端論壇牆報，2017；
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