解析脊髓灰質炎病毒2C ATPase的晶體結構，為揭示小RNA病毒科複製機制再邁進一步

導 讀

近日，中國醫學科學院，病原生物學研究所崔勝研究員團隊解析了2.55埃解析度的脊髓灰質炎病毒（Poliovirus）2C ATPase晶體結構。他們發現，PV 2C與EV71 2C的結構（同一團隊在2017年完成結構解析http://advances.sciencemag.org/content/3/4/e1602573）相似。PV 2C同樣通過C端alpha螺旋與鄰近的2C分子結合，發生自身寡聚化。他們還發現，PV 2C具有CCCC型鋅指，EV71 2C具有CCC型鋅指；這類鋅指的結構與以往發現的8類鋅指家族均不相同，屬於新類型鋅指，命名為「Enterovirus 2C-like group」；PV 2C和EV71 2C鋅指結構的差異決定了2C蛋白的特異性。綜合近20年2C蛋白的研究成果，他們在2C六聚體上繪製了2C功能及抑製劑結合的完整圖譜，為理解2C在病毒複製中的作用及2C抑製劑設計提供了關鍵信息。相關研究成果在線發表於PLOS Pathogens。

研究背景

自世界衛生組織發起脊髓灰質炎根除計劃以來，根除PV病毒的目標仍未完成。至今，仍有少數國家存在PV病毒流行，其中2個與我國接壤（巴基斯坦和阿富汗）。為了徹底消除PV的威脅，研發抗病毒藥物是重要的疾病控制手段之一。

PV屬於腸道病毒C種，包括三個血清型。雖然不同的腸道病毒的衣殼存在較大差異，但其編碼的複製酶高度保守。在腸道病毒編碼的複製酶中，2C蛋白可能是最重要的direct-acting antivirals (DAA)藥物靶標。目前，至少發現了10種2C抑製劑，包括了guanidine hydrochloride, HBB, TBZE-029, MRL-1237, pirlindole, dibucaine, zuclopenthixol, hydantoin, fluoxetine和brefeldin A等，其中大多數抑製劑的靶點是PV 2C。然而，PV 2C的高解析度結構信息始終無法解析，阻礙了抑製劑的研發。

結果速覽

崔勝研究團隊成功解析了一個PV2C可溶性片段晶體結構。該片段缺失N-端膜結合區，但保留了完整的ATP酶結構域，鋅指和C-端alpha螺旋域。他們發現，PV2C通過C-端螺旋發生自身寡聚化（圖1）。這種特徵與EV712C高度相似，從而表明：2C蛋白通過C端兩親性helix介導六聚體組裝的機制在腸道病毒中是保守的。

Fig 1.PV2C形成依賴C-端的多聚體

PV 2C和EV71 2C在結構上最大的差異來自於鋅指。EV71 2C具有一個CCC三鋅指幾何結構，而PV 2C具有一個CCCC四鋅指幾何結構。通過三維結構的比對發現，PV 2C和EV71 2C的鋅指與蛋白質資料庫中已知的8類鋅指的構象截然不同。因此，他們將這一類新型鋅指歸為第9類鋅指，並命名為「Enterovirus 2C-like」鋅指家族（圖 2 )。鋅指通常參與蛋白-蛋白間相互作用。PV 2C和EV71 2C之間鋅指的差異暗示了這兩種蛋白特異性的差別。

Fig 2：腸道病毒2C具有新型鋅指摺疊，與已知的8類鋅指家族均不相同

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結 語

自上世紀90年代以來，人們對PV 2C蛋白進行了大量系統的研究。無數遺傳學和生物化學的研究數據鑒定出PV 2C中大量的藥物耐受位點和功能相關區域。崔勝研究團隊把所有重要的氨基酸位點和區域首次集中展示在PV 2C六聚體模型的表面（圖3）。可以看到，（1）藥物耐受的氨基酸位點集中在六聚體細胞質一側（正面），圍繞在六聚體中央隧道的周圍（紅色和紫色區域），表明這一區域是藥物作用的重要靶點；（2）鋅指（黃色）位於六聚體模型的六個頂點，暗示這裡是與其他蛋白相互作用的重要位置。這些發現為設計抗病毒藥物提供了重要科學依據。

Fig 3：小RNA病毒2C功能及抑製劑結合位點圖譜

中國醫學科學院，病原生物學研究所關洪鑫（現在單位：福建師範大學生命科學學院），田娟和張楚為本文共同第一作者；中國醫學科學院，病原生物學研究所崔勝研究員為本文通訊作者。該項研究得到了國家重點研究和發展計劃和國家自然科學基金等資助。

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Title

Crystal Structure of a Soluble Fragment of Poliovirus 2CATPase

Abstract

Poliovirus (PV) 2CATPase is the most studied 2C protein in the Picornaviridae family. It is involved in RNA replication, encapsidation and uncoating and many inhibitors have been found that target PV 2CATPase. Despite numerous investigations to characterize its functions, a high-resolution structure of PV 2C has not yet been determined. We report here the crystal structure of a soluble fragment of PV 2CATPase to 2.55?, containing an ATPase domain, a zinc finger and a C-terminal helical domain but missing the N-terminal domain. The ATPase domain shares the common structural features with EV71 2C and other Superfamily 3 helicases. The C-terminal cysteine-rich motif folds into a CCCC type zinc finger in which four cysteine ligands and several auxiliary residues assist in zinc binding. By comparing with the known zinc finger fold groups, we found the zinc finger of 2C proteins belong to a new fold group, which we denote the 「Enterovirus 2C-like」 group. The C-terminus of PV 2CATPase forms an amphipathic helix that occupies a hydrophobic pocket located on an adjacent PV 2CATPase in the crystal lattice. The C-terminus mediated PV 2C-2C interaction promotes self-oligomerization, most likely hexamerization, which is fundamental to the ATPase activity of 2C. The zinc finger is the most structurally diverse feature in 2C proteins. Available structural and virological data suggest that the zinc finger of 2C might confer the specificity of interaction with other proteins. We built a hexameric ring model of PV 2CATPase and visualized the previously identified functional motifs and drug-resistant sites, thus providing a structure framework for antiviral drug development..

https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1007304

DOI：10.1371/journal.ppat.1007304

撰 稿：張楚，關洪鑫

本期編輯：Yinyuan

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