復旦大學基礎與臨床科研人員合力揭開患者血清中乙肝病毒RNA神秘的面紗

近日，由復旦大學上海醫學院醫學分子病毒學重點實驗室袁正宏課題組與復旦大學附屬公共衛生臨床中心（以下簡稱「公衛中心」）科學研究部慢性乙型肝炎研究組、肝炎科、華山醫院傳染病研究所通力合作揭開了乙肝病毒(HBV)RNA分子在患者血清中的神秘面紗。相關研究成果以「Extracellular HBV RNAs are heterogeneous in length and circulate ascapsid-antibody-complexes in addition to virions in chronic hepatitis Bpatients」為題發表在國際病毒期刊《Journal of Virology》雜誌上（論文鏈接https://jvi.asm.org/content/ early/2018/09/28/JVI.00798-18）。

發表文章截圖

乙型肝炎病毒（HBV）是一種嚴重影響人類健康的病原體，也是引發慢性乙型肝炎（慢乙肝）的元兇。根據國際衛生組織2015年最新估計，全球約有2.4億慢乙肝患者，大多分布在低收入及中等收入國家，每年約有65萬患者死於慢乙肝感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝細胞癌。在我國，現有9300萬慢乙肝感染者，在肝硬化和肝細胞癌患者中，由乙肝病毒引發的比例分別高達60%和80%。隨著我國乙肝疫苗接種的推行，我國嬰幼兒的乙肝陽性率有了大幅度的降低。然而，對於其他已經感染病毒者，仍缺乏徹底治癒的療法，從而給大量家庭帶來了沉重的經濟負擔和健康威脅。

全球HBV感染情況

大量臨床與基礎研究表明，慢乙肝長期遷延不愈的根本原因在於乙肝病毒共價閉合環狀DNA (cccDNA)在肝內的長期存在以及隨之造成的慢性活動性肝炎。由於cccDNA僅在患者肝臟中存在，為快速簡易地檢測其水平，臨床亟需外周血替代標誌物用於評估患者長期治療效果。長期以來，學術界公認HBV是一種不完整環狀雙鏈DNA病毒， RNA只是作為病毒複製過程中的前體（前基因組RNA， pgRNA）或者作為編碼病毒蛋白的信使RNA(mRNA)存在於感染細胞內，在患者血清中只存在HBV DNA。在尋找合適的替代標誌物過程中，1996年Koch等人意外發現血清中存在HBV RNA。隨後數年中，這一現象逐漸被越來越多的同行所確認，並發現在核苷類似物治療過程中，其水平的下降較HBV DNA更為平緩，由此一些學者提出HBV RNA可以作為抗病毒藥物治療長期療效的預測標誌物。由於HBV RNA為cccDNA的轉錄產物，且對抗病毒藥物的敏感性明顯低於HBV DNA，不少學者提出可以將它作為肝內cccDNA的替代標誌物，因而受到日益關注。

HBV複製周期

雖然血清HBV RNA越來越受到關注，但HBV RNA在血清中以何種形式存在仍有很多不明確之處。分析文獻報道，目前主要有以下幾種觀點：1. HBV RNA 以前基因組RNA （pgRNA）包裝於病毒顆粒的形式存在；2. 由pgRNA以及各種剪切RNA （splicedRNA）形式包裝於病毒顆粒中；3.HBV RNA可能被宿主外泌體(exosome)等囊泡狀結構非特異包裹釋放。

為了從分子水平明確血清HBV RNA的存在形式，在袁正宏研究員帶領下，公衛中心科學研究部張小楠副研究員與復旦大學基礎醫學院白露博士聯合臨床科研工作者對HBV RNA開展了系統性的研究。首先在HBV複製細胞系(HepAD38)中，通過蔗糖密度梯度離心、氯化銫密度梯度離心等經典方法分離上清中各種病毒顆粒，並對其中的核酸類型和形式做了仔細的考察。結果發現，在細胞上清中，HBV RNA主要存在於裸衣殼(naked capsids)中（佔比>85%）， 而病毒顆粒中只佔少數（

攻關小組進一步將研究重點轉移到病人血清中HBVRNA分析。與細胞上清結果類似，血清中HBV RNA長度不一，均短於pgRNA。但令人意外的是，氯化銫密度梯度離心未能將不同類型病毒顆粒有效分離，而是呈現廣泛的密度分布。依據細胞水平的考察結果，研究團隊大膽假設，在病人血清中也有可能存在類似裸衣殼的亞病毒顆粒，但由於病人血清中存在高滴度的核心抗體(HBcAb)，因此推測這類顆粒可能以衣殼-抗體複合物（Capsid-Antibody-Complexes, CACs）形式存在，從而表現為浮力密度（buoyant density）的高度異質性。後續通過採用包括免疫沉澱、非變性瓊脂糖電泳、電子顯微鏡等一系列實驗技術，研究團隊證實血清中存在抗體所包裹的亞病毒顆粒，且為HBV RNA的主要載體。

遊離HBV RNA的分子形式和它的主要載體衣殼-抗體複合物（CACs）的形成模式

這項研究系統性分析了遊離HBV RNA的分子形式，澄清了在這個領域存在的一些概念混淆，在國際上首次提出了衣殼-抗體複合物（Capsid-Antibody-Complexes, CACs）存在且為血清HBV RNA的主要載體，建議將其納入到經典的HBV複製理論中。這項研究的相關成果將對學術界和臨床工作人員更好運用HBV RNA這一指標，更準確解讀HBV RNA水平在抗病毒治療過程中的意義，提供重要的理論依據。

該研究得到十三五傳染病防治重大專項，國家重點研發計劃，國家自然科學基金的資助。此次發表的研究論文，白露為第一作者，袁正宏、張小楠為共同通訊作者。渥太華大學訪問學者Maya Kozlowski教授，華山醫院傳染病研究所黃玉仙、張繼明主任，公衛中心肝炎科陳良主任等也為該研究作出了重要貢獻。

編輯：ipsvirus

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