微生物所在酵母中開發CRISPR-Cas9介導的多重基因組編輯新技術

漢遜酵母（Ogataea polymorpha）是一種重要的工業微生物，常被用於研究甲醇利用、自噬、過氧化物酶體生物合成和硝酸鹽同化等。除此之外，它有一個重要的特性，就是能夠通過NHEJ將多達100個拷貝的靶基因整合到基因組上，這一特性可用於過表達外源基因合成多種產物。雖然CRISPR/Cas9基因編輯技術已經在O. polymorpha中成功建立，但是多基因的編輯技術尚未實現。

中國科學院微生物研究所病原室溫廷益研究組與工業室何秀萍研究組合作在漢遜酵母中建立了一套CRISPR-Cas9介導的多基因編輯技術（CMGE），尤其用於多基因一步敲除、多位點（ML）、多拷貝（MC）目標基因的同時插入。由於O. polymorpha中沒有穩定的遊離載體，Cas9和gRNA被整合到基因組上進行表達，先將Cas9基因通過同源重組的方式整合到基因組上，然後將表達gRNA的質粒線性化並與修復模板同時轉入整合了Cas9基因的O. polymorpha中，最終達到基因編輯的目的（圖1）。為了實現多基因的同時敲除，研究人員靶向三個基因：OpURA3，OpHIS3和OpLEU2，並將相應的三個修復模板與線性化後的gRNA質粒轉入O. polymorpha中，最終多基因編輯效率達到了23.61± 6.36%。

為了實現多拷貝基因插入，Cas9基因在誘導型啟動子PMox的控制下表達，並選擇具有50-60重複的rDNA（核糖體DNA（rDNA）是編碼核糖體RNA的DNA序列。在酵母中，rDNA通常由高拷貝數的相同重複序列組成，這些重複序列頭尾相連成簇存在）簇作為整合位點，整合gfpmut3a表達框，編輯效率為75.00±12.5％，拷貝數最高達11.15±1.10個。並通過傳代驗證多拷貝基因的插入在傳代18.5天（55代）後仍然穩定存在（圖2）。

研究人員利用CMGE在O. polymorpha中實現了多基因敲除、多位點、多拷貝基因的同時插入以及精準的點突變，並利用CMGE實現了白藜蘆醇、戊二胺和人血清白蛋白（HSA）的生物合成，證明了CMGE在O. polymorpha基因工程中的實用性和有效性。此外，CMGE-MC方法也被證明適用於模式酵母釀酒酵母。

圖1 O. polymorpha中CRISPR-Cas9介導的基因編輯系統

圖2 多基因同時整合與多位點同時插入示意圖

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