《分子治療》刊發基因治療專家的評論，對李紅良的猴子實驗再發質疑

撰文 | 葉無言

責編 | 陳曉雪

針對李紅良的猴子實驗，本不期待再有任何嚴肅討論出現。

自今年六月在《自然醫學》的「交鋒」後 [1]，6位美國基因治療領域的專家感到失望。「我們提出批評，他卻回復了一堆垃圾。」 其中一位專家事後說道。他們認為，不值得再為此浪費時間。

不料，2018年9月18日上線的《分子治療》（Molecular Therapy）刊發評論 [2]，又有一位基因治療領域的專家發表了批評意見。

魔鬼藏於細節

文章作者為法國基因治療專家Federico Mingozzi博士，主要研究腺病毒相關病毒（AAV）與免疫系統的相互作用，也做AAV載體的基因療法的臨床前和臨床開發 [3]。

與此前6位美國專家的看法一致，Mingozzi博士強調為何要做中和抗體篩查，以及為什麼再次給葯是徒勞的：

「由於人類和非人類靈長類動物（NHP）暴露於野生型AAV，它們通常攜帶抗衣殼中和抗體（NAbs），可以與用於基因轉移的幾種不同的血清型交叉反應。此外，在載體給葯後，就很快產生大量的抗AAV中和抗體，而且會一直存在體內數年，因此也導致無法再次給葯。」

李曾在首次給葯7周後，對50隻實驗猴進行過四肢周圍靜脈的注射。雖然，在答覆中，李承認「至少不會有壞處」，但依然很難理解為何「大動干戈」做這樣的無用功。

除了這些基本問題，Mingozzi博士進一步指出，由於各種原因，包括給葯途徑、載體劑量和製法，AAV載體對中性抗體的易感性不盡相同，因此，「對於確保在臨床前和臨床研究中結果的準確闡釋，明確定義基因轉移的基本免疫學參數是重要的。」

顯然，Mingozzi博士認為還存在諸多疑問。

李在給美國6位專家的回複信中稱，實驗猴是經過仔細預篩選過抗AAV8中和抗體的，沒有刊登篩選結果是因為「不覺得有必要報告這些數據。」 但Mingozzi認為，雖然這可以是一個合理的陳述，但鑒於中和抗體的濃度與基因轉移效率相關，建議還是要指明用於預篩選動物的方法和測量實際中和抗體濃度的方法。

Mingozzi進一步指出，似乎選出來用在研究中的猴子的中和抗體濃度上限為1:10，高於血清陰性動物所含中性抗體的上限值，儘管李沒有提供用於篩選的檢測方法的靈敏度的詳細信息。

此外，李沒有報告第7周載體重新給葯時，測量的中性抗體濃度，「儘管事實上，在這種情況下，知道中和抗體的濃度對於了解載體重新注射成功與否非常有用」，Mingozzi在評論中寫道。

最後，Mingozzi提醒，「將基因轉移方法從小型動物轉移到大型動物和人類，研究人員應仔細考慮AAV載體的免疫反應。這種考慮不僅限於衣殼，還涉及使用像GFP（綠色熒光蛋白）這樣的報告轉基因，綠色熒光蛋白在小鼠中是耐受的，但在靈長類動物中可以具有高度的免疫原性。」在李的猴子實驗中，沒有任何的免疫原性的評估。

令人生疑的學術調查

加上這位法國專家，圍繞著篩查和重複給葯，公開質疑李紅良《自然醫學》論文的專家已經有9位。

回顧事件發展，在本刊1月18日首次披露李紅良兩篇《自然·醫學》論文涉嫌造假，當時的質疑僅說，猴子實驗周期不夠，基因治療並非通過肝臟門靜脈注射。武漢大學在1月29日發布結論，認為李的團隊「不存在學術造假」。

做出這一結論的學術依據是該校前後兩次組織的學術調查。第一次是2017年12月8日，武漢人民醫院組織了5人專家組，包括了3名校外院士。第二次是1月26日，武漢大學學術委員會組織的會議，請了校內校外專家各7名。

根據武漢大學公布的信息，校內專家包括學術委員會主任、院士李德仁，3名副主任（含1位同行院士），1名校學術委員會同行院士，2名校內同行專家。校外的同行專家有7人，包括了2名院士。如此，14人的調查組有5位院士，4位同行院士，凸顯了「權威性」。

但此後，事件的發展已經遠遠超出當初的認知，包括新的是否進行了篩查和重複注射問題。那麼，調查組專家當初注意到這些問題了么？在9位國外基因治療領域的專家公開質疑後，他們還會維持之前的結論么？因為他們應該查看了李實驗組的全部原始實驗記錄，應該是最有可能回答這些問題的人。

遺憾的是，與之前的迅速反應形成鮮明對比，迄今為止，武漢大學仍然保持沉默。

與此同時，基因治療領域的專家已經不太願意繼續「學術」討論。當然，這並不是說李的回復打消了他們的疑慮。相反，是他們看到李的回復後，失去了繼續與之討論的興趣。

以下是筆者收到的幾條評論：

「我們這些作者認為我們的目的已經達到了，不想繼續糾纏下去。以後大家都會注意這些決定實驗成敗的關鍵細節。The devil is in the detail（魔鬼藏於細節）。是非曲直，自有公論。」

「在我看來，你不會改變這個人的道德。不過，我相信至少警告的作用起到了，審稿人將來會更加慎重檢查他的研究。要是我的話會做一些更有意義的事，而且總會有像這樣的應該從領域內清除出去的人。他的自我傲慢將來某天會讓他自食其果，我建議不要浪費你們的時間，因為任何用AAV做猴子實驗的不用想都知道，不能向他宣稱的那樣做重複給葯。諷刺的是，他不再認同之前的做法，暗示（重複給葯）或許不起作用，典型的說謊，自相矛盾。」

「我們也看到了李紅良教授的回複信。首先想說明我們寫給《自然醫學》那封信的目的並不是針對某個實驗室，而是就事論事。因為現在採用AAV基因載體開展動物實驗和臨床試驗的實驗室越來越多，我們在這個領域工作了幾十年，想讓大家了解AAV基因載體在動物實驗方面應該注意的問題，以免誤導實驗結果。

預存抗體在放養動物和人群中是非常常見的，這些抗體無疑或多或少會中和AAV病毒顆粒，從而降低甚至完全阻斷其介導的基因遞送。這個現象在通過血管注射時甚為顯著，因為抗體在血液中大量存在。但是，在免疫相對隔絕的組織，譬如大腦和眼底，抗體含量很低甚至缺失。另外，如果通過肌肉注射，注射部位病毒濃度相對較高而抗體含量相對較低，不足以有效阻斷基因轉導。

值得強調的是，第一次注射AAV載體之後，體內中和抗體會大量產生，從而導致重複注射幾乎不可能，特別是血管注射。隨著越來越多的臨床試驗出現了令人振奮的結果，為了解決更多病人能接受AAV基因治療和以後重複給葯的問題，如何消除預存抗體和阻斷中和抗體的產生，已經成為基因治療領域一個非常重要和挑戰性很高的課題。幸運的是，佛羅里達大學Barry Byrne教授已經率先在這方面取得了突破性的進展。他的團隊在小鼠，猴子和人臨床試驗中，首先發現用CD20抗體清除Ｂ細胞，加上雷帕黴素免疫抑制，可以有效防止AAV中和抗體的產生，因此，這個重大成就奠定了今後如何應對中和抗體的基礎，為更多的新技術的出現創造了一個良好的開端。」

「我支持肖衛東，高光坪等在今年6月《自然醫學》和Mingozz博士在最新一期《分子治療》中對李的質疑，也支持之前霍文哲對李學術不端的指責。因為對李紅良的工作和學術作風不以為然，已經有先入為主的心判，所以擔心評論會有所偏頗。很抱歉我不能對此發表我的評論，謝謝。」

參考資料以及補充說明

[1] 最新進展 | 《自然醫學》刊登美國六位專家質疑 ，李紅良回應

[2] AAV Immunogenicity: A Matter of Sensitivity, https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2018.09.001

[3]Federico Mingozzi之前是巴黎第六大學的副教授，曾在法國國家健康和醫學研究所擔任主管，目前就職於法國的Genethon和美國Spark Therapeutics，兩家進行基因治療產品研發的機構。

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