精準腫瘤學的關鍵目標是改善癌症的診斷和治療。而對腫瘤樣本的一系列基因組和其它分子分析能夠幫助發現標誌物來幫助選擇療法，預測預後，跟蹤腫瘤進化，以及發現不同轉移性疾病的分子特徵。基於下一代基因組測序（NGS）的分子分析方法已經在腫瘤分析方面得到應用，而綜合DNA、RNA、蛋白質和表觀遺傳特徵的多參數綜合分析可能更準確地描述腫瘤特徵並且幫助發現全新成藥靶點。

目前，精準腫瘤學的焦點愈發轉向液體活檢，因為它不具侵襲性，而且可以在不同時間點重複進行，從而幫助監察疾病的進展。如今，外周血液中可以被檢測的分析物（analyte）包括循環腫瘤細胞（CTCs）；循環無細胞DNA（cfDNA），在癌症患者中它包含循環腫瘤DNA（ctDNA）。其它分析物物包括循環無細胞RNA（cfRNA）；細胞外囊泡（EVs），例如外泌體和腫瘤「教育」的血小板（TEPs）；蛋白質和代謝產物。近日，《Nature Reviews Genetics》 對在精準腫瘤領域液體活檢的現狀和未來進行了盤點，在今天的這篇文章里，葯明康德的微信團隊將與讀者分享這篇綜述的精彩內容。

本文轉載自「葯明康德」（來源：《Nature Reviews Genetics》）。

01

ctDNA作為生物標誌物的利與弊

ctDNA檢測是目前市場上最常見的液體活檢形式，它在具備巨大潛力的同時，在檢測開發和臨床應用的推廣方面也面對著一系列挑戰。

ctDNA作為精準腫瘤學生物標誌物的潛力

研究表明，ctDNA可能由凋亡細胞釋放，因此，它只代表了腫瘤細胞的一種特定亞群。儘管如此，ctDNA具有多個優點：

1. 它能夠提供對腫瘤基因組的綜合描述，因為ctDNA從多個不同腫瘤區域或多個病灶處釋放，ctDNA分析可以發現組織活檢中無法發現的體細胞突變。

2. 深度測序可以發現腫瘤內異質性和只在部分細胞中出現的基因突變。這通常需要大量的CTCs或者多次組織活檢才能獲得同樣水平的信息。

3. ctDNA可以提供腫瘤大小的信息，從而反映出疾病的發展狀態和對療法的反應。研究發現，在非小細胞肺癌（NSCLC）和高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）中ctDNA的突變等位基因頻率（VAF）與腫瘤體積呈線性關係。

4. ctDNA還具備預測預後的價值。例如，在旨在治癒的手術或化療之後，ctDNA的出現是癌症複發和不良預後的有力標誌。它預測癌症複發的能力在結腸癌、卵巢癌、肺癌和乳腺癌患者中都得到了驗證。

5. ctDNA分析能夠發現腫瘤抗性的標誌物，例如，在接受抗EGFR療法的結直腸癌患者中出現的KRAS突變，以及在乳腺癌患者中的PIK3CA、MED1、或EGFR上VAFs的升高。

這些優點讓ctDNA成為精準腫瘤學應用方面前景看好的分析物。然而ctDNA檢測也需要克服血漿中ctDNA水平過低，細胞衰老帶來基因變異的影響等挑戰。

組織活檢與ctDNA檢測特點對比（圖片來源：參考資料[1]）

血漿中低水平ctDNA帶來的挑戰

在血漿cfDNA中檢測到基因突變的能力與腫瘤負擔有對應的關係。但是在不同患者身上的ctDNA水平可能相差很大，雖然他們患上同樣類型的癌症。即使是在轉移性癌症患者中，也有很大一部分患者血漿中ctDNA的比例異常的少。這清楚地表明，除了腫瘤負擔以外，還有其它生物因素影響腫瘤DNA的釋放。

據估算，1毫升血漿中含有大約1500個基因組當量（GE）的DNA片段，通常一次10毫升抽血可以從血樣中獲得4毫升血漿，意味著能夠獲得6000 GE的DNA片段。在VAF為0.1%的情況下，在這6000 GE的DNA片段中，平均只有6個DNA分子攜帶著想要檢測到的基因突變，而且隨機取樣可能會影響這一數值。因此，可靠、準確並且可重複地檢測到這些基因突變是一個嚴峻的挑戰。

檢測低水平ctDNA的方法

如果增加血樣體積，可以檢測到的分子數目自然會顯著上升，但是多抽血的辦法通常在晚期癌症患者中無法實現。另外一種克服攜帶基因突變的分子數目過少的方法是同時檢測多種基因突變，然後確定一個基因突變數目的最低閾值來決定血漿樣本是否為腫瘤陽性。例如，有的液體活檢可以同時檢驗患者是否攜帶18種單核苷酸位點變異（SNV），如果檢測到的SNV數目超過2個，則將ctDNA樣本定義為腫瘤陽性。

近年來ctDNA檢測技術的開發主要聚焦於增強測序技術的分析敏感度。測序技術的敏感度會受到測序準確性和測序深度的影響。通過使用分子條形碼標記被測序的DNA片段，可以提高測序的準確性，從而提高發現基因突變的幾率。

另一種提高敏感度的嘗試是富集特定長度的ctDNA片段。有研究表明ctDNA 片段（132-145個鹼基對）通常比健康細胞釋放的cfDNA片段（~166鹼基對）小。因此，富集特定大小的DNA片段進行測序可能提高發現基因突變的敏感度。

影響循環無細胞DNA檢測敏感度的因素（圖片來源：參考資料[1]）

細胞衰老對ctDNA檢測的限制

雖然這些技術的進步能夠改善發現低VAF基因突變的能力，但是衰老細胞積累的體細胞突變也會對ctDNA的實用性添加限制。其中一個重要的干擾因素是良性體細胞基因突變隨著細胞衰老而增加。在成人幹細胞中出現的良性基因突變會隨著細胞增殖傳給下一代，有的時候在腫瘤驅動基因中出現的基因突變會導致攜帶這些突變的幹細胞增殖速度更快，這可能被誤認為腫瘤增生。因此，在腫瘤驅動基因中發現基因突變並不等同於發現癌症。

ctDNA檢測的分析效度和臨床有效性仍需確認

在臨床護理中採納腫瘤生物標誌物檢測的原則有三條：1. 分析效度（analytical validity），指的是檢測的準確性、可靠性和可重複性；2. 臨床有效性（clinical validity），指的是檢測能夠把患者分為不同群體，而且這些群體會有不同臨床後果的能力；3. 臨床實用性（clinical utility），指的是接受檢測的患者的臨床後果與未接受檢測的患者相比，是否有所改善。

目前，市場上的ctDNA 檢測的結果一致性和臨床有效性還未得到完全確認。有研究使用兩種不同的ctDNA檢測方法對同一批樣本進行檢測，試驗結果表明，在34個接受檢測的樣本中，只有9個樣本在兩種ctDNA檢測中給出了完全一致的結果。這種數據讓人對這些檢測的分析效度和臨床有效性產生疑慮。目前，業界需要進行多中心研究，使用足夠大的患者群來確認ctDNA檢測的分析效度和臨床有效性。

而且，檢測的標準操作程序和指導需要得到統一。歐洲標準化委員會（CEN）已經發布了處理和紀錄用於ctDNA分析的血樣的標準程序。其它國際組織也在致力於將液體活檢的流程標準化。如果想將基於NGS的液體活檢在臨床中廣泛推廣，它們必需接受完備的檢驗並且通過基於確認標準的質量檢測。

02

新興的液體活檢分析方法

以精準腫瘤學的需求來看，現有的液體活檢技術還存在很多不足。但通過擴大信息獲取與檢測的範圍，我們有望實現液體活檢技術的真正潛力。在這一段中，我們也將介紹目前新興的一些液體活檢方法。

1. 組織與癌症特異的DNA甲基化模式分析

在表觀遺傳學中，CpG的甲基化是基因表達和組織分化的重要調控方式。近年來，隨著人們對組織特異甲基化組學的了解不斷加深，通過分析甲基化的模式，我們可以推斷出cfDNA的組織來源，檢測癌症。由於在癌症發病初期，DNA就會出現甲基化修飾的變化，該技術有望在早期就協助醫生做出癌症診斷。這一理念已經在實驗中得到了驗證——2017年的兩篇論文表明，我們有望在乳腺癌和卵巢癌得到臨床確診的2年前，就在外周血液中檢測出腫瘤特異的甲基化變化。但這一技術目前也存在著瓶頸，主要難點在於獲取足夠數量的循環腫瘤細胞，以及對於單細胞甲基化模式的分析。

2. 核小體位置分析

血液中cfDNA的主要形式是受單個核小體保護（mononucleosomal protected）的DNA。和甲基化模式類似，來自不同細胞的cfDNA，其核小體所處的位置也有所不同。因此通過對這些核小體位置的分析，我們也能推導出cfDNA的來源。

3. miRNA分析

在生物學研究中，循環RNA在RNA-seq，qPCR，以及microarray等方面有著多樣的應用。在諸多RNA內，miRNA由於其在血漿或血清中的穩定性得到了廣泛的關注，也有不少人期望能將其開發成有用的診斷工具。舉例來講，有些科學家希望能使用低劑量計算機斷層掃描（low-dose computed tomography ，LDCT）技術，在高風險的個體中對肺癌進行早期檢測。而miRNA的評估有望減少LDCT技術較高的假陽性率。一些研究表明，miRNA與LDCT技術的結合，能將後者的假陽性率減少5倍！

不同液體活檢分析方法面對的挑戰和潛在解決方法（圖片來源：參考資料[1]）

4. 分析細胞外囊泡的轉錄組和基因組

細胞外囊泡是核酸與蛋白質的載體，在細胞與細胞，乃至器官與器官間的交流中起到了重要作用。從運輸能力上看，細胞外囊泡最多能運載近100個蛋白質和約10kb長的核酸。在核酸方面，miRNA大約佔了40.4%，piwi-互作RNA佔了約40%，剩下的則是假基因（pseudo genes），lncRNA，tRNA，以及mRNA。這些RNA分子中的信息有望用於確認癌症起源，做出早期診斷。除了核酸分子外，細胞外囊泡上的一些粘附分子（如整合素）也能用於推斷器官特異的癌症轉移。

值得一提的是，外泌體（exosome）可以由活性癌細胞直接分泌。與ctDNA進行配合，可以從多個角度展示腫瘤的生物學特徵，做出更準確的診斷。當然，健康組織也會分泌大量外泌體，其中的遺傳物質也會帶有變異。因此在臨床應用上，我們還需要更好地對外泌體的行動進行追蹤。

5. 經過腫瘤「教育」的血小板

腫瘤細胞有時會將生物分子轉移到血小板上，這個過程也被形象地稱為「教育血小板」。有趣的是，這些信息可以被用於區分癌症患者。在一項研究中，科學家們收集了228個癌症樣本，而對於這些經過腫瘤「教育」的血小板進行RNA-seq，科學家們可以將局部和轉移癌症患者與健康人區分開來，準確度達84%-96%。區分腫瘤來源的準確度也達到了71%。這是因為不同的癌症類型，會把不同的分子帶給血小板。當然，這一技術目前還停留在較初步的階段。為了讓它得到更好的應用，我們還需要了解腫瘤「教育」血小板的具體過程。

6. 蛋白質分析

細胞的正常運作離不開蛋白質，而許多疾病的根源正是蛋白質的突變。然而除了PSA（前列腺特異抗原）外，目前臨床上我們能使用的蛋白標誌物少之又少，且大多無法區分其來自哪些組織或癌症。蛋白質組學的蓬勃發展給了人們契機，讓我們建立了高質量的蛋白關聯性圖譜。目前，我們已經可以利用這些技術，明顯提高液體活檢在早期癌症中的檢測率。

7. 代謝物分析

腫瘤的生長發育往往會影響到人體生理上的變化，尤其是全身的代謝狀況。對於腫瘤來說，它們能肆意改變自己的代謝通路，而血液中的代謝產物可能會成為有用的癌症標誌物。目前比較為人熟知的一個案例是BCAA，它能預示腫瘤發育早期對代謝調控的干擾——胰腺癌的發病早期，BCAA水平會有所上升。而在非小細胞肺癌里，BCAA的水平則會下降。這些結果表明代謝物的組成可能成為液體活檢的重要部分。

8. 活性循環腫瘤細胞分析

近年來，單細胞分析技術有了飛躍式的發展，這也讓科學家們得以更為詳細地分析循環腫瘤細胞內的基因組、轉錄組、蛋白質、以及表觀遺傳組信息。其中，來自活性循環腫瘤細胞的信息對於評估癌症轉移有著重要的作用。除此之外，這些細胞也能被用來建立患者特異的腫瘤模型。但首先，我們還需要解決不同癌症種類中循環腫瘤細胞的丰度問題。比如非小細胞肺癌就很少會帶來循環腫瘤細胞。

03

液體活檢技術面臨的挑戰

任何一項技術在剛剛邁入應用之際，總是充滿了挑戰，液體活檢也不例外。儘管有多種新興分析方法不斷湧現，但這一技術的發展前方依舊充滿挑戰。

1.真正理解血漿成分

關於液體活檢最大的爭議之一，在於我們是否真正了解了血漿成分。舉例來講，過去人們認為ctDNA主要來自凋亡的癌細胞，但最近對ctDNA的一些分析卻找到了一些和癌細胞增殖有關的變化，刷新了認知。因此為了更好地理解細胞如何將DNA釋放到循環系統中，我們還需要更深入地了解健康人與癌症患者中，血漿的組分與各個組織之間是怎樣的一個關係。截止到目前，我們做的還非常不夠。

舉例來說，不少關於組織特異性的研究，其專註的只有少數集中細胞類型，探索血漿cfDNA來源的研究也寥寥無幾。這容易給分析帶來偏差——不少研究指出白血球是循環核酸的主要來源，佔比範圍在42%-90%。然而最近的一項研究卻發現，幼紅細胞來源的DNA在健康人里，中位佔比大概是30.1%，而這是先前人們從來沒有報道過的組織來源。可想而知，不同的分析方法得出的結論究竟有多大的區別，這也反映了我們對於血漿cfDNA組成的無知。

2. 液體活檢與免疫腫瘤學

液體活檢與免疫腫瘤學的交織，是最近的研究熱點之一。當循環腫瘤細胞離開原發腫瘤之後，就會暴露在免疫監控之下。因此，它們也需要一定的免疫逃逸機制才能生存。目前我們已經知道，這些循環腫瘤細胞有能力改變自己的MHC I呈遞、改變NK細胞配體表達、或是下調FAS/FASL的表達。理解這些變化，有助於免疫腫瘤學的發展。

通過對循環腫瘤細胞進行液體活檢，還能帶來實際的應用價值。最近，人們通過抗PD-L1抗體，發現在這些細胞上也有PD-L1的表達。這些信息可以用於患者細分。

此外，我們還能通過分析ctDNA里的腫瘤突變負擔（TMB），了解檢查點抑製劑的潛在效果。這是因為TMB越高，產生新抗原的幾率就越高。一些研究也表明，TMB能用來找到哪些患者在免疫療法的治療後，在臨床上能有更好的預後。

綜合多種參數，從液體活檢樣本中發現癌症（圖片來源：參考資料[1]）

3. 對多種參數的測量與整合

如果要給液體活檢展望一下未來，成功檢測最小殘留病灶可以說是一個目標。最終，我們希望能在早期對癌症進行診斷。要實現這些目標，有時我們只需要檢測一個指標就夠了。最近，2017年葯明康德生命化學研究獎得主盧煜明教授領銜的一支團隊發現，只要在外周血液里檢測Epstein–Barr病毒的DNA，就能篩選出早期的鼻咽癌患者。許多專家認為這項研究堪稱是里程碑。

但更多的情況下，一個指標是遠遠不夠的。在涉及多個指標的案例中，我們還需要考慮參數整合的問題。在最早的一些嘗試中，人們主要綜合的是ctDNA與蛋白標誌物。舉例來說，CA19-9、TIMP1、以及LRG1等蛋白標誌物，輔以對KRAS基因突變的檢測，能夠找到腫瘤可切除的前列腺癌患者，且檢測率要高於只使用ctDNA的方法。

最近，一種叫做CancerSEEK的早期癌症檢測策略浮出水面。在一項招募了1005名志願者，涉及8種常見癌症類型的臨床研究中，蛋白質與遺傳標誌物的組合，猜對癌種的中位正確率為70%。由於致癌基因突變未必具有組織特異性，想要區分癌症的來源，還是要靠對蛋白質的分析。但這種技術容易帶來假陽性，且在早期癌症的檢測中效果不佳。

儘管如此，研究人員們依舊指出，通過整合不同標誌物的分析結果，液體活檢的潛力看好。在前列腺癌與胰腺癌的診療上，我們已取得了一些可喜的進展。

4. 機器學習遇上液體活檢

人們也意識到，綜合考量多種指標需要較高的計算能力，而機器學習演算法則有望自動發現和檢測癌症特異的指標，助力液體活檢。這可能涉及簡單的邏輯回歸，也可能涉及複雜的多層人工神經網路。

事實上，機器學習技術已經在液體活檢中取得了一些成績。比如利用深度學習的方法，我們能以更高的靈敏度和特異性去探測循環腫瘤細胞；用基於神經網路的miRNA分析，我們可以區分健康女性和罹患卵巢癌的女性，特異性達100%。

但目前利用機器學習演算法的最大短板，在於獨立觀察數據的不足。該綜述指出，目前患者的樣本量一般在幾十到幾千之間，而按鹼基的解析度計算，單名患者就可能產生數百億的數據。在理想的情況下，設置機器學習演算法時，前者應比後者的數量來得更多。比如經典的圖像處理AI，處理的樣本高達數百萬，而潛在的分析特徵只有幾千，兩者的數量級之間有著明顯的差距。在數據不足的前提下，機器學習演算法可能會出現過度擬合。它能很好地解釋訓練數據，但無法用於新的數據。

04

結語和展望

液體活檢在腫瘤學方面的應用日益增多。然而，我們需要對液體分析物的產生機理和水平動態進行更深入的了解，同時需要確認液體活檢的臨床有效性和臨床實用性，這樣才能進一步推廣液體活檢的臨床應用。

目前，大多數檢測都只聚焦於一種分析物，然而將血液中存在的多種分析物的數據綜合起來構成的多參數檢測可能大幅度改善檢測的精確度和使用範圍。這些檢測技術的開發需要使用創新統計工具，它們能夠使用多維機器學習方法來整合從一個樣本中獲取的大量數據。

因此，未來的液體活檢研發將橫跨多個學科，包括基礎生物學和生理學、分子生物學、檢測技術、統計學和機器學習。非常關鍵的一點是，只有當液體活檢的臨床有效性和臨床實用性得到證明之後，這項技術才能發揮它全部的潛力，為基因組驅動的腫瘤學和癌症患者的臨床管理帶來重大影響。

茫茫微信公眾號中相遇不容易，星標☆生物探索，不要和探索君走散喲！

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