JVI：中國科學家揭示了基孔肯亞病毒複製重要蛋白nsP1的棕櫚醯化機制

導 讀

基孔肯亞病毒（CHIKV）屬於披膜病毒科甲病毒屬，為正鏈RNA病毒。其感染後最典型的癥狀是關節疼痛，因此，基孔肯亞病毒和相關病毒也被稱為致關節炎甲病毒（arthritogenic alphavirus），目前尚無針對CHIKV的特定疫苗和藥物。脂肪酸合酶（FASN，Fatty acid synthase）參與的脂類代謝過程對於病毒RNA的複製十分重要，但是，FASN如何參與和影響CHIKV的複製的機制尚不清楚。

近日，中國醫學科學院病原生物學研究所張磊亮團隊在基孔肯亞病毒nsP1的棕櫚醯化機制方面取得新進展，相關研究於2018年11月7日以」Fatty acid synthase promotes the palmitoylation of Chikungunya virus nsP1」為題發表於國際病毒學期刊Journal of Virology。研究發現FASN可以通過影響基孔肯亞病毒nsP1蛋白的棕櫚醯化影響病毒的複製，並確定了nsP1的棕櫚醯化位點及參與nsP1蛋白棕櫚醯化的棕櫚醯轉移酶，為闡明病毒的複製機制、探討病毒於宿主的相互作用以及研發抗病毒藥物和疫苗的製備提供了科學依據。

圖 基孔肯亞病毒nsP1棕櫚醯化機制模式圖

研究背景

基肯孔雅病毒（CHIKV）於1952~1953年首次在坦尚尼亞南部地區的馬孔德高原發現。基孔尼亞的命名與當地俚語有關，chikungunya在馬孔德語中意為「使人彎曲的病毒」。由於感染該病毒的患者會發展為腳踝、手腕、膝蓋等關節炎，其運動能力受到部分影響。病毒感染初期患者會出現急性高熱、關節痛及大面積皮疹的癥狀，進一步發展到癥狀表現嚴重且持續時間較長的慢性病時期。雖然患者在感染後大都可以自愈，但仍有部分患者在感染後未能自愈，且受關節疼痛困擾長達10年。

基孔肯亞病毒基因組大小約12kb，由兩個ORFs（Openreadingframes）組成，共編碼9個蛋白，其中分為4個非結構蛋白（Non?structuralprotein，nsP1?4）和5個結構蛋白（C，E3，E2，6K和E1）。CHIKV病毒複製產生非結構蛋白多聚體（Non?structuralpolypro?tein）nsP123和nsP1234。其中，成熟的nsP1具有病毒在複製過程中需要的酶功能，主要包括NTPase，RNA三磷酸酶以及RNA解旋酶和甲基轉移酶，主要為新合成的病毒RNAs進行加帽和甲基化處理。nsP1對於病毒的複製十分重要，它不僅是病毒複製複合物的主要組成部分，而且參與病毒RNA複製過程中在細胞內膜系統的定位。

細胞脂類代謝對於CHIKV的複製過程十分重要，S-棕櫚醯化是脂質翻譯後修飾的一種重要形式，它通過調節蛋白的轉運、穩定性和定位來影響蛋白的功能。已有研究表明，FASN參與的脂類代謝過程CHIKV複製至關重要，但其分子機制尚不清楚。

研究結果

1、FASN的活性對於CHIKV的複製是必需的

首先，研究團隊探討了脂肪酸合成酶（FASN）的兩個抑製劑C75和cerulenin對CHIKV的抑制作用。研究者將HeLa細胞分別用不同劑量的C75或cerulenin處理，然後感染CHIKV疫苗株181/25 (MOI)=1，並通過nsP1的免疫印跡和RNA水平檢測病毒的複製情況，通過ATP的水平分析細胞的存活情況。結果發現，C75和cerulenin均能抑制CHIKV的RNA和蛋白水平，進而證實了FASN的活性對於CHIKV的複製是必需的（Fig1）。

Fig. 1. FASN activity was required for CHIKVreplication.

2、棕櫚酸（PA）能夠拯救FASN抑製劑對病毒複製的抑制作用

進一步的，研究探討了脂肪酸合成酶FASN的重要產物——棕櫚酸PA以及棕櫚醯化抑製劑2-BP對病毒的複製影響。研究者將HeLa細胞先感染CHIKV疫苗株181/25 (MOI)=1，然後分別用FASN抑製劑cerulenin/ cerulenin+PA/C75/ C75+PA或棕櫚醯化抑製劑2-BP/2-BP+PA/2-BP/+硬脂酸(SA)處理。並通過nsP1的免疫印跡和RNA水平檢測病毒的複製情況，通過ATP的水平分析細胞的存活情況。結果發現，棕櫚醯化抑製劑2-BP能夠削弱基孔肯亞病毒感染，而棕櫚酸能拯救2-BP對病毒的抑制作用，該作用可能是通過棕櫚酸促進蛋白的S棕櫚醯化實現的（Fig2）。

Fig. 2. Palmitic acid could rescue the inhibitory effectsof 2-BP and FASN inhibitors on CHIKV replication.

3、FASN抑製劑降低了nsP1的棕櫚醯化

進一步的，研究證實了基孔肯亞病毒nsP1蛋白是否能發生棕櫚酸化修飾。研究者將Huh7.5.1細胞先感染CHIKV疫苗株181/25 (MOI)=1，並測定了nsP1的棕櫚醯化水平；同時將nsP1-Flag真核表達質粒轉染293T細胞或Hela細胞後，再加入脂肪酸合成酶抑製劑處理，最後通過免疫印跡或共聚焦進行分析。結果發現，nsP1蛋白可以發生棕櫚酸化修飾，FASN抑製劑降低了nsP1的棕櫚醯化（Fig3）。

Fig. 3. Palmitoylation of nsP1 was reduced by a FASN inhibitor.

4、CHIKV nsP1棕櫚醯化的關鍵位點是417-419 的三個半胱氨酸

為了進一步探討nsP1棕櫚醯化的關鍵氨基酸位點，研究者結合蛋白棕櫚醯化預測和系列棕櫚醯化生化鑒定發現，nsP1蛋白S棕櫚醯化的關鍵位點位於417-419的三個半胱氨酸（圖4）。

Fig. 4. The crucial sitesof nsP1 were the three cysteines located at sites 417-419.

5、CHIKV nsP1 417-419位點的半胱氨酸對CHIKV複製至關重要

抑制nsP1的棕櫚醯化減少了nsP1在細胞表面的定位。將CHIKV病毒nsP1的棕櫚醯化位點突變後，細胞內病毒RNA水平顯著下降，與野生型相比大約降低了四個數量級，這說明nsP1蛋白的棕櫚醯化與病毒複製相關。這些結果表明，脂肪酸合成酶抑製劑對病毒的抑制可能是因為nsP1蛋白的S棕櫚醯化受到影響（圖5）。

Fig 5. Mutation of nsP1palmitoylation sites inhibited CHIKV replication.

6、ZDHHC2和ZDHHC19促進nsP1的棕櫚醯化和CHIKV複製

棕櫚醯化轉移酶（ZDHHC）的鋅指D-H-H-C結構域是介導蛋白S棕櫚醯的主要結構域，但是，具體何種棕櫚醯化轉移酶介導了基孔肯亞病毒的nsP1尚不清楚。為了進一步確定nsP1的棕櫚醯化轉移酶，研究團隊對影響基孔肯亞病毒nsP1蛋白棕櫚醯化的棕櫚醯基轉移酶進行了系統篩選。通過免疫共沉澱實驗發現，ZDHHC2 和ZDHHC19與nsP1有很強的相互作用，當敲降細胞內的ZDHHC2和ZDHHC19後，nsP1蛋白的棕櫚醯化水平明顯下降，而且病毒複製受到抑制（圖6，7）。

Fig. 6. ZDHHC2 and ZDHHC19 interacted with nsP1 and mediate nsP1 palmitoylation.

Fig. 7. ZDHHC2 and ZDHHC19 were important for CHIKV replication.

小結

本研究聚焦基孔肯亞病毒複製中的關鍵蛋白nsP1，證實了脂肪酸合成酶抑製劑通過降低nsP1的棕櫚醯化影響CHKIV的複製，確定了nsP1的棕櫚醯化位點及參與nsP1蛋白棕櫚醯化的棕櫚醯轉移酶，為深入研究CHIKV的感染機制提供了重要線索，由於nsP1在甲病毒中高度保守，本研究也為研究甲病毒屬病毒蛋白的棕櫚醯化提供了思路，為進一步闡明病毒的複製機制、探討病毒於宿主的相互作用以及研發抗病毒藥物和疫苗的製備提供了科學依據。

ABSTRACT

Chikungunya virus (CHIKV) is transmitted to people by mosquitoes, and CHIKV infection causes fever andjoint pain. Fatty acid synthase (FASN) has been identified as a proviral factorfor CHIKV. How FASN participates in CHIKV replication remains to be elucidated.In this study, we demonstrated that palmitic acid (PA) can restore thesuppression of CHIKV replication by FASN inhibitors. The palmitoylation andplasma membrane localization of CHIKV nsP1 were reduced by FASN inhibitors.Triple mutation of Cys417, Cys418, and Cys419 in nsP1 blocked itspalmitoylation and severely disrupted CHIKV replication. Furthermore, twozinc-finger D-H-H-C domain-containing palmitoyl transferases (ZDHHCs) includingZDHHC2 and ZDHHC19 promoted nsP1 palmitoylation and CHIKV replication. Ourresults not only identified the key enzymes for the palmitoylation of nsP1 butalso provided mechanistic insights into the roles of FASN in CHIKV replication.Importance S-Palmitoylation is an important form of lipid posttranslationalmodification, which affects the function of proteins by regulating theirtransport, stability and localization. Previous studies have shown that FASN iscritical for CHIKV replication; however, the mechanism for this function ofFASN remains unknown. The key zinc-finger D-H-H-C domain-containing palmitoyl transferasesinvolved in the palmitoylation of nsP1 are not clear. We demonstrated that FASNpromoted CHIKV replication through nsP1 palmitoylation. ZDHHC2 and ZDHHC19 wereidentified as the major enzymes for nsP1 palmitoylation. Since nsP1 proteinsare conserved in alphaviruses, our results highlight the mechanisms by whichalphavirus nsP1 is palmitoylated.

Importance

S-Palmitoylation is animportant form of lipid posttranslational modification, which affects thefunction of proteins by regulating their transport, stability and localization.Previous studies have shown that FASN is critical for CHIKV replication;however, the mechanism for this function of FASN remains unknown. The keyzinc-finger D-H-H-C domain-containing palmitoyl transferases involved in thepalmitoylation of nsP1 are not clear. We demonstrated that FASN promoted CHIKVreplication through nsP1 palmitoylation. ZDHHC2 and ZDHHC19 were identified asthe major enzymes for nsP1 palmitoylation. Since nsP1 proteins are conserved inalphaviruses, our results highlight the mechanisms by which alphavirus nsP1 ispalmitoylated.

1. Zhang N, Zhao H, Zhang L.Fatty acid synthase promotes the palmitoylation of Chikungunya virus nsP1.JVirol. 2018 Nov 7. pii: JVI.01747-18.

doi: 10.1128/JVI.01747-18.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30404808

2.醫科院病原所在基孔肯亞病毒蛋白棕櫚醯化機制研究方面取得新進展.Virologica 中國病毒學英文版.

3. 殷瀚，張磊亮．基肯孔雅病毒宿主因子和限制性因子的研究．病毒學報.

https://doi.org/10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003366

本期編輯：Annabella

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