為了避免被氧化，霍亂弧菌竟能暫時「變身」

病原體在入侵宿主的過程中需要適應不同的環境條件，其中一道難關就是宿主體內代謝產生的活性氧。南京農業大學朱軍教授研究團隊發現，為了適應高活性氧環境，霍亂弧菌能夠增強過氧化氫酶的表達或突變為褶皺型表型。這種利用 DNA 錯配修復系統來研究複雜環境中細菌調控行為的模型可以得到更為廣泛的應用。相關研究「Hypermutation-induced in vivo oxidative stress resistance enhances Vibrio cholerae host adaptation」已發表於《PLoS Pathogens》。

撰文 南京農業大學

編輯 戚譯引

病原細菌在入侵宿主致病的過程中需要「過五關斬六將」，既要適應氧氣、pH等環境因素的改變，又要躲避宿主免疫系統、氧化脅迫等攻擊。求生欲旺盛的細菌會很聰明地進行特定基因的修飾和調控，化解不利因素，成功存活和定殖。

以著名的急性傳染病霍亂（cholera）為例，它的始作俑者霍亂弧菌（Vibrio cholera）是一種革蘭氏陰性細菌，當人類食用了被霍亂弧菌污染的水源或食物後，霍亂弧菌進入人體、定殖於小腸併產生毒素，導致「米泔水樣」腹瀉，引起代謝性酸中毒和急性腎功能衰竭，甚至導致患者死亡。而在感染人體的過程中，霍亂弧菌不僅要通過胃酸屏障，躲避宿主免疫系統的攻擊，還要應對宿主體內不斷升高的活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。

ROS 是生物有氧代謝過程中的一種副產品，包括氧離子、過氧化物和含氧自由基等，過高濃度的 ROS 會對細胞和基因結構造成損傷-。目前已知霍亂弧菌會通過不同調控蛋白對 KatG、KatB、Dps、PrxA 等過氧化氫酶和過氧化物酶進行調控，從而消除 ROS，但仍有不少問題尚未研究清楚。

為了進一步了解霍亂弧菌在體內條件下如何應對宿主 ROS 壓力，研究採用了兩種小鼠模型：以鏈黴素處理後體內 ROS 水平升高的小鼠（NAC-）作為高 ROS 模型，增加抗氧化劑 N-乙醯半胱氨酸（N-acetyl cysteine，NAC）處理後 ROS 水平明顯回落（NAC+）的小鼠則作為低 ROS 模型。藉助 Tn-seq 高通量測序技術，我們將霍亂弧菌的轉座子突變株文庫分別灌入NAC+和NAC-小鼠，以尋找僅在高 ROS 條件下對霍亂弧菌定殖起重要作用的基因。

實驗發現，DNA 錯配修復系統中的關鍵基因——mutS發生突變的菌株在NAC-小鼠腸道中大量富集，但在NAC+小鼠中則沒有這種優勢。也就是說，mutS突變後的菌株在高 ROS 環境下具有強烈的定殖優勢（圖1）。

圖 1 | 圖片由作者提供

研究本意是要尋找抗氧化相關的關鍵基因，結果卻定位到了修復系統的基因。修復系統缺失後，霍亂弧菌在體內的突變率增強了近百倍，這有助於在短期內增強進化適應性，但也會付出一些長期代價。

那麼霍亂弧菌在氧化壓力環境下發生了什麼變化呢？我們將從NAC-老鼠中體內分離的ΔmutS立刻進行了回補（稱為ΔmutS*），以「鎖住」在NAC-老鼠中有定殖優勢的突變，避免其進一步突變。將這些ΔmutS*再重新接種入小鼠後，發現它們在NAC-小鼠中仍然具有定殖優勢、但在NAC+小鼠中表現平平（圖2），毒力檢測顯示其和野生株相比沒有差別，表明修復系統缺失後，霍亂弧菌在宿主體內自發產生了特異性針對高 ROS 環境的突變。

圖 2 | 圖片由作者提供

那麼霍亂弧菌究竟發生了什麼變化，可以在高 ROS 環境下獲得定殖優勢呢？研究發現，從NAC-老鼠體內分離的ΔmutS缺失株具有兩種特徵：一些缺失株產生了更多的過氧化氫酶，從而增強了對 ROS 的降解能力；而另一些雖然過氧化氫酶沒有明顯增加，但菌落形態發生了變化，從光滑型菌株（smooth）轉化為褶皺型菌株（rugose）（圖 4A、4B）。進一步實驗確認，褶皺型菌株可以通過產生更多生物膜，來獲得比光滑型菌株更強的定殖能力。此外，這些褶皺型菌株在體外有氧條件下能重新回復成光滑形態（圖4C），甚至已經回補了mutS基因的ΔmutS*也會體外回復。

以上結果表明，面對宿主體內的氧化脅迫時，霍亂弧菌一方面通過增強過氧化氫酶的表達化解氧化壓力，另一方面也通過突變為褶皺型表型來應對不利條件，但這種策略是暫時性的，在無壓力的條件下可以回復的。

圖 3 | 圖片由作者提供

本研究中採用通過突變細菌 MMR 系統基因進行體內自發突變、並在體外分離後立刻回補 MMR 系統基因的研究方式，利用具有不同 ROS 壓力的小鼠模型，了解了霍亂弧菌在體內抵禦氧化脅迫的機制。這種突變研究策略可以將不同環境和壓力下獲得優勢的突變株進行富集，通過基因和表型的對比，從而快速有效地研究細菌調控行為。這種研究模型不僅有助於對多種病原細菌在特定條件（例如低 pH、活性氮、乾燥脅迫等）下的研究，還可以在複雜多因素環境中進行應用。此外，研究模型還有助於改善現有的抗菌方式，預測細菌會以何種突變方式來逃避殺菌物質，從而降低出現抗藥性變異的風險。

南京農業大學生命科學學院王卉副教授為本文第一作者和並列通訊作者，朱軍教授為本文通訊作者。本研究也獲得了中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所闞飆研究員和逄波研究員、華中科技大學劉智教授的幫助，此外也感謝林萬芳和林法德小姐多年來的精神鼓勵。

論文信息

【標題】Hypermutation-induced in vivo oxidative stress resistance enhances Vibrio cholerae host adaptation

【作者】Hui Wang, Xiaolin Xing, Jipeng Wang, Bo Pang, Ming Liu, Jessie Larios-Valencia,Tao Liu, Ge Liu, Saijun Xie, Guijuan Hao, Zhi Liu, Biao Kan, Jun Zhu

【期刊】

【時間】2018/10/30

【DOI】10.1371/journal.ppat.1007413

【摘要】Bacterial pathogens are highly adaptable organisms, a quality that enables them to overcome changing hostile environments. For example, Vibrio cholerae, the causative agent of cholera, is able to colonize host small intestines and combat host-produced reactive oxygen species (ROS) during infection. To dissect the molecular mechanisms utilized by V. cholerae to overcome ROS in vivo, we performed a whole-genome transposon sequencing analysis (Tn-seq) by comparing gene requirements for colonization using adult mice with and without the treatment of the antioxidant, N-acetyl cysteine. We found that mutants of the methyl-directed mismatch repair (MMR) system, such as MutS, displayed significant colonization advantages in untreated, ROS-rich mice, but not in NAC-treated mice. Further analyses suggest that the accumulation of both catalase-overproducing mutants and rugose colony variants in NAC- mice was the leading cause of mutS mutant enrichment caused by oxidative stress during infection. We also found that rugose variants could revert back to smooth colonies upon aerobic, in vitro culture. Additionally, the mutation rate of wildtype colonized in NAC- mice was significantly higher than that in NAC+ mice. Taken together, these findings support a paradigm in which V. cholerae employs a temporal adaptive strategy to battle ROS during infection, resulting in enriched phenotypes. Moreover, ΔmutS passage and complementation can be used to model hypermuation in diverse pathogens to identify novel stress resistance mechanisms.

【鏈接】

https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1007413

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