血液處理和白細胞分離方法影響免疫細胞的整體轉錄組

轉錄譜分析可以為組織和疾病的細胞狀態和表型提供寶貴的信息。這種方法特別適用於在例如藥物或疾病狀態等干擾情況下對細胞和組織進行研究，所得到的數據有助於推測感興趣的目標通路、獨特的功能狀態、與疾病狀態的相關性以及新的亞型分類。

某些測序方法，例如Smart-Seq2，能夠利用從極少量細胞(大約1-1000)中提取的RNA來測定轉錄組，因此能夠分析細胞數目極低、細胞類型罕見或依賴於生物標記材料的臨床樣本。許多研究已經確定了低輸入或降解RNA樣本的最佳處理程序和分析方法。全血防腐劑和穩定劑的使用也使得利用極少量血獲取高質量數據成為可能。然而，將轉錄組分析應用到臨床樣本(如組織和已分類的細胞群)在樣本採集、樣本處理和組織分離方面遇到了獨特而重大的挑戰。例如，多中心研究常常需要對患者樣本進行集中處理，這種轉移有引入偏倚的風險。此外，RNA質量在組織之間可能存在很大差異，這或許會影響實驗設計。對於稀少或難以處理的樣品而言，僅靠獲取足夠的高質量樣品並不總能實現高RNA質量目標隊列的規模要求。

以往的研究很少關注RNA測序過程中由於樣本處理而引入轉錄組數據的人為因素。對於微陣列或定量PCR產生的表達譜，已有研究發現一些能夠影響結果數據的因素。其中一項研究表明，標準白細胞採集程序之前的培養時間可以迅速改變血液的轉錄組。在4°C進行運輸可能會減輕這些變化，但無法完全消除影響。另一個研究利用微陣列技術探尋了時間、溫度和保存對分離外周血單核細胞(PBMCs)轉錄組的影響：每一種保存材料都對轉錄組有影響，但依賴於大量的血液。到目前為止，只有少數的研究闡明了通過白細胞分離方法和低輸入RNA測序所引入的人為影響因素。

在這篇文章中，研究人員描述了血液處理、白細胞分離方法和血液中分離得到的少量免疫細胞的保存方法對轉錄組的整體影響。他們發現，在白細胞分離和分類之前，血液的儲存/運輸溫度會導致CD8+ T細胞和單核細胞的整體變化，包括免疫相關基因的改變。通過使用白細胞過濾系統，這些變化可以被最小化。研究人員使用這種方法從來自急性腦出血患者血液的免疫細胞中獲得了高質量的轉錄組數據，並與健康對照組相匹配。這些數據證明了這種過濾方法的實用性，並強調了在進行轉錄組分析之前，必須使用明確的、緊密匹配的方法來處理樣本。

圖1. 樣品處理方法模式圖。本圖描述了臨床免疫學中用到的不同樣品處理方法，圖中包括血液運輸溫度(20°C或4°C)，外周血單核細胞分離方法（Ficoll梯度、卡拉膠酶加Percoll梯度、全血溶解、白細胞過濾），以及所研究的不同類型的免疫細胞（CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、粒細胞或單核細胞）。

本研究的結果強調了在轉錄組研究中使用明確的可比較的方法十分必要，同時提出了一種能夠用於快速分離目的免疫細胞並使得轉錄組分析偏倚最小化的過濾方法。

BMC Immunology

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