Nature：從頭合成細胞

本文轉載自「生命奧秘」。

僅靠八個元件、兩個蛋白質、三個緩衝元件和兩個脂肪分子，再加上一些化學能量，就足以形成一串「活潑好動的」基礎細胞樣結構，而且還可以自我分裂。

這就是生物物理學家Petra Schwille創造出來的奇蹟，這些會「跳舞」的小精靈是我們從頭開始合成細胞的第一步。為此，Schwille在德國馬克普朗克生物化學研究所（Max Planck Institute of Biochemistry in Martinsried, Germany）付出了十年的努力。

Schwille一直在思考生命和非生命的區別。對她來說，最大的難點就在於判斷哪些組份才是構成生命體的必要元素。在Schwille的人工合成細胞里，她知道每一個因素的作用。

二十多年來，科研人員一直努力地創造人造細胞，他們的方法就是將各種生物分子按照某種方式組合起來。雖然有各種各樣不同的方法，但是大致可以分為以下三大類，分別是想辦法將生物分子包裹在某一個空間內；或者研究足以維持生命的生物化學系統；或者研究細胞行為的信息控制、儲存和管理問題。

得益於近年來微流體技術的進步，科研人員可以精細調控細胞組分之間的微小活動，所以人工合成細胞這方面的工作也在加速開展之中。目前科研人員已經找到了一些方法，可以將細胞樣的小泡塑造成我們需要的樣子，也創造出了一些最基本的細胞代謝能力，而且還成功地將人造基因組轉移到活體細胞里。但是要想將所有成分全部組裝到一塊，挑戰還是很大的。

但是科研人員還是充滿了信心。2017年9月，荷蘭17家實驗室的科研人員一起組成了「構建人造細胞組織（Building a Synthetic Cell, BaSyC）」。據該組織的負責人兼荷蘭德爾夫特理工大學（Delft University of Technology）的生物物理學家Marileen Dogterom介紹，他們的目標是在十年之內，人工合成出一個細胞樣的、可生長和可分裂的新東西。目前，他們已經得到了1880萬歐元（約合2130萬美元）的荷蘭引力基金（Dutch Gravitation grant）的支持。

今年9月，美國國家科學基金會（US National Science Foundation, NSF）宣布了他們的第一個人工合成細胞項目，並表示將為此投入大約1000萬美元。包括Schwille在內的多個歐洲的研究人員也都建議擁有10億歐元資金的歐盟委員會未來新興技術項目（European Commission』s Future and Emerging Technologies Flagship）對人工合成細胞給予經費支持。

從頭開始的合成生物學家都預計第一批具有真正意義的人工合成細胞將在大約十年之後誕生。Schwille就對此充滿了信心。

全都在一起

科研人員已經在人工合成細胞的多個方面取得了不錯的進展，尤其在模擬生物膜方面成果突出。這主要是因為組織分子的關鍵就在於如何讓它們在合適的時間和地點發揮作用。雖然我們可以將十億個細菌打碎，將細菌裂解物全都倒在一支試管里，但是這些細菌在試管里的生物學反應卻不能維持很久。我們必須將其中的某些成分分離出來，同時也必須讓其中的某些成分混在一起。

德爾夫特理工大學的另外一位生物物理學家Cees Dekker表示，對他來說，這就是一個分子組成的社會。

最開始，這意味著將生物分子在生物膜上，或膜結構內排列起來。Schwille及其課題組成員就是這方面的專家。大約在十年前，他們開始嘗試添加Min蛋白。這種蛋白可以指導細菌分裂，並可以將人造脂質膜分裂成一片一片。後來他們又發現，Min蛋白可以讓生物膜彈起來，形成波動（wave）和旋動（swirl）。但是將Min蛋白加入3D立體的球狀生物膜結構中時，生物膜球會破裂。於是Schwille等人嘗試使用微流體技術來解決這個問題，從而構建出了細胞大小的生物膜結構——脂質小體（liposome）。這種脂質小體解決了蛋白質加入的問題，我們可以在其中，或者表面插入各種蛋白質。

Schwille的學生Thomas Litschel等人將Min蛋白溶於水，然後將這些蛋白溶液放入試管，

並在振蕩器上快速振蕩，隨後這些溶液形成了蛋白小液滴。緊接著再將它們與濃稠的脂質液體混合，離心，就能夠形成包裹了Min蛋白的脂質小體。這種脂質小體大約有10~20微米大小，剛好就是植物和動物細胞的水平。這些脂質體也被稱作巨大單層囊泡（giant unilamellar vesicles, GUV）。雖然很多方式都可以製備這種物質，但是Litschel等人的GUV因為有了Min蛋白，所以可以震動、收縮，並且四處遊動。

Schwille等人希望利用他們對這些Min蛋白質的研究成果來吸引資金。她表示，她們真的理解這些分子，也非常想知道這些蛋白質能夠做出什麼。也許可以像Litschel等人那樣，利用這些Min蛋白來指導生物膜分裂，或者聚集成一個個小的細胞器樣的結構等。很多物理學家會使用膠帶和錫箔來做實驗，Schwille覺得她們手上的那些蛋白也可以起到類似的作用。Schwille認為自己天生就是一個專門做實驗的材料。

脂質小體製造技術

科研人員利用微流體技術來生產脂質小體。這些脂質小體與細胞膜結構非常類似。其中有一種技術會用到6條微流體，使它們彙集到一處，如上圖所示。在1-辛醇的環境中，脂質雙分子層會被包裹在內部。經過幾分鐘之後，這些1-辛醇會脫落，剩下完整的脂質小體。

Dekker的團隊成員還利用上圖所示的微流體晶元往脂質小體里塞進了各種蛋白質。在這種微流體晶元里，有兩個通道充滿了脂質分子，還有一個通道里充滿了水分子，最終產生的細胞大小的脂質小體里就可以裝入各種生物分子了，也可以保持膜的狀態，在容器里自由地漂浮。

Dekker的團隊還對這些脂質小體進行了加壓、變形和重塑等各種實驗，最終獲得了非球形的脂質小體，以便可以更好地模擬細胞的形態。有了微流體設備，科研人員可以更好地控制脂質小體的移動、分選和操控。Dekker等人今年還設計了一款晶元，能夠人工使一個脂質小體一分為二，具體方法就是用外力將脂質小體擠成兩半。當然這不是Dekker等人追求的最終目標，他們的目標是希望脂質小體可以由內而外地自發分裂。但這個實驗也給我們提供了很多有意思的信息。比如，在分裂脂質小體時，脂質小體可以承受多大的力量和承受哪種力量等。Dekker團隊還對活體大腸桿菌的形狀進行了研究，他們用硅樹脂納米纖維材料製作了一種模子，從而讓大腸桿菌變得更方、或者直徑更大。他們通過這種途徑來研究細胞的形狀對細胞的分裂有何影響，同時了解Min蛋白在不同形狀和不同大小細胞里的作用。

Dekker打趣道，他們使用納米技術做了其他正常細胞生物學家絕對不會做的實驗。但是像他這樣不正常的生物物理學家都會這麼干。

再加點能量進去

現在，我們已經可以往脂質小體里加點東西了，科研人員需要思考的問題是如何讓這些細胞組份正常地運作起來。幾乎所有的生命體細胞都需要能量，最常見的形式就是ATP。雖然我們也可以往人造細胞里添加ATP，但是很多從事從頭合成工作的生物學家還是堅持，真正的細胞應該有自己的能量供給來源，類似於動物細胞的線粒體（mitochondrion）和植物細胞的葉綠體（chloroplast）。

德國海德堡馬克斯普朗克醫學研究所（Max Planck Institute for Medical Research in Heidelberg, Germany）的Joachim Spatz等人就構建了一個人造線粒體概念機，可以自發產生能量物質ATP。

他們也在其中利用了最新型的微流體技術。首先，Spatz等人將GUV置於水油混合液滴（water-in-oil droplets）里，使其能夠穩定存在，這些水油混合液滴則處於一個由多聚體物質構成的黏性環境（即多聚體外殼）中。當這些水油混合液滴沉到底部的毛細通道之後，科研人員就會往其中注入大型蛋白質分子，這些蛋白質會進入GUV，或者固定在GUV的表面。

人工細胞生產線

藉助Pico微注射系統就可以往脂質小體這種人造細胞膜結構中添加各種蛋白質。首先，脂質小體被置於多聚體外殼內，待其穩定後將脂質小體注入毛細通道。在電流的作用下，目標蛋白就會被插入脂質小體內，或者脂質小體的膜上。

Spatz等人利用上圖這種設備在脂質小體的膜上插入了ATP合酶蛋白質（ATP synthase）。這些ATP合酶就好像一台水車一樣，當有質子通過脂質小體膜時，就可以利用ATP的前體物質，生產出ATP。實驗發現，當GUV外部的酸性增強時，在GUV的內部真的產生了ATP。

Spatz表示，他們可以讓這些GUV再次通過毛細通道，添加其它蛋白質，如此往複，就可以添加多種細胞組份。他們接下來就計劃加入其它成分，使GUV可以自己在膜內外形成質子梯度。這樣一來，就和我們人體內一樣了，是非常重要的一環。

德國馬堡馬克斯普朗克地球微生物研究所（Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology in Marburg, Germany）的生物化學家Tobias Erb也是研究合成生物學的，他們也在細胞代謝領域裡有所發現。Erb關注的是光合作用微生物（photosynthetic microbes）利用二氧化碳生成糖和其它物質的代謝途徑。

Erb使用的是空板（blank-slate）方法來合成細胞代謝通路。據他介紹，從工程學的思維出發，我們首先思考的是如何設計，然後是如何將設計圖真的建造出來。

Erb團隊設計了一個系統，可以將二氧化碳轉化成蘋果酸（malate），而蘋果酸就是光合作用最關鍵的代謝物。他們估計，這條代謝通路的效率要比光合作用的還要強。接下來，Erb團隊的工作就是在資料庫中搜索，看看都有哪些酶可以供他們使用。有些酶也許需要先改造一下才可以滿足他們的要求。

最後，Erb團隊一共找到了17種酶，這些蛋白質來自9種不同的生物。比如有大腸桿菌、古細菌（archaeon）、擬南芥（Arabidopsis）和人類。這個反應不出意外的話，效率應該是很低的。

Erb指出，雖然他們將多種酶組合在一起，但結果並不理想。不過經過人工改造之後，目前已經升級到5.4版，反應效率已經比大自然中的光合作用強了20%。

接下來，Erb等人又開始了人工葉綠體的打造工作。他們用研缽將菠菜碾碎，然後加入人造光合系統，結果在紫外光的照射下真的生成了ATP，也將二氧化碳轉化成了蘋果酸。Erb認為，雖然他們在試管中取得了成功，但是我們最終需要的是真正的人造葉綠體。他非常希望能夠與Kate Adamala等合成生物學家合作，構建出複雜的細胞器。

美國明尼蘇達大學（University of Minnesota in Minneapolis）的Kate Adamala實驗室正在開發可控生物反應器（programmable bioreactors）。他們的方案就是將簡單的生物通路置入脂質小體，然後將這些人造細胞聚集起來，形成複雜的生物反應器。她將這個系統比喻做「可以製造蛋白質的肥皂泡」。

Adamala團隊使用和Schwille等人類似的試管旋轉方法來製造她們的生物反應器，不過她們生成的脂質小體個頭會小一點。Adamala團隊在其中還加入了編碼各種蛋白質的質粒，以及整個蛋白質表達系統。

比如，她們就製造了一種生物反應器，可以感知所處環境里的抗生素水平，因為當抗生素分子通過脂質小體膜上的小孔進入生物反應器內部時，就會產生生物發光信號（bioluminescent signal）。

如果將一個個生物反應器按照一定的順序組合起來，就可以打造出一套更加複雜的生物反應通路。但是當反應器（或組份）的數量超過十個時，這個系統就崩潰了。這是目前合成生物學領域裡面臨的最大挑戰。在真正的細胞里，可能會彼此影響的蛋白質都被分隔在不同的細胞器里。因此，科研人員必須想辦法，了解如何在結構簡單的人造細胞里控制這些蛋白質的作用，以避免它們相互影響。比如可以建造一套外部的門控系統，由操作人員來決定這些脂質小體什麼時候組合，什麼時候分開。還可以添加一些化學標籤，控制不同的脂質小體之間的結合，或者使用時間釋放控制系統（time-release system）等。

再來點信息

人工合成細胞除了上面那些「硬體」條件之外，還有一個重要的因素，那就是需要相應的「軟體」。如何讓人工合成細胞「聽話」，這就需要信息的引導和指揮了。在真正的生命體（從微生物到人類）內，這就是基因負責的工作。

那麼在人工合成細胞里需要多少個基因呢？這一直是大家爭論的焦點。Schwille等人認為幾十個就夠了，可是Adamala等人卻堅持至少需要兩三百個。

有些科研人員沒有選擇從頭開始的合成路線，而是選擇從活細胞開始。比如美國加州J. Craig Venter研究所的合成生物學家John Glass就使用目前地球上已知的、基因組最小的微生物——蕈狀支原體（Mycoplasma mycoides）為原材料，通過減少該基因組裡基因的數量，來了解到底多少個（哪些）基因就足以支撐一個細胞的生存。他們得到實驗結果之後，就在實驗室里用化學合成的方法，重新製作了一個最簡基因組。

這個最簡基因組一共含有473個基因，這隻有蕈狀支原體原始基因組大小的一半。然後，Glass等人將這個人工基因組植入山羊支原體（Mycoplasma capricolum）細胞。2016年，Glass等人發現這個人工合成基因組可以維持細胞的存活，只不過細胞的生長速度比較慢。鑒於此，他認為，不能再減少基因的數量了，否則就會讓細胞死亡，或者無法維持細胞的生長。

Glass等人正在根據他們最新的研究成果JCVI-syn3.0a，編寫一部「細胞任務清單（cellular tasks）」，這也將成為製作最簡細胞的藍本。但是面對這大約100個基因，還是無法區分哪些屬於必需基因。

接下來，Glass和Adamala在NSF提供的大約100萬美元的支持下，還將嘗試將JCVI-syn3.0a基因組組裝進脂質小體里，這個脂質小體里同時裝載了整套蛋白質表達系統，他們想看看這個徹頭徹尾的人工細胞是否可以存活。

如果這個人工細胞可以正常地生長、繁殖，那麼將是一個巨大的進步。但是很多人都不認為這是一個真正意義上的活體系統，因為它還得具有進化和環境適應能力才行。Schwille認為，這也是最大的挑戰，是最難預料的。一個只能複製自己的東西還不能被稱作生命，真正的生命還需要發展出新的能力。

Glass的團隊正在對他們的JCVI-syn3.0a進行適應性進化實驗，他們在富營養環境中進行實驗，因為細胞在這種條件下的生長速度更快，更有利於選擇。到目前為止，細胞已經分裂了400次，Glass等人已經篩選出了生長速度比之前提升了15%的「新品種」。而且還觀察到了很多基因序列變異的情況。但是目前還沒有證據顯示這些細胞發展出了新功能，或者提高了適應能力。

Erb認為，給人造細胞添加進化能力，是唯一的出路。生物系統里的混亂（ messiness ）就是讓它們進步的動力。作為工程師，我們不能製造出一個完美的細胞。我們需要開發的是具有自我糾錯能力，能夠自己越變越好的細胞。

這些人造細胞也可以告訴我們其它星球上的生命可能是什麼樣子的。一個完全受控的生物反應器也可以為我們開發新的抗癌藥和解決抗生素耐葯問題，並為清除毒物提供幫助。如果將這些人造細胞植入人體，或者自然環境中，還是有一定風險的，但是自上而下地改造生命也同樣會帶來不可預知的風險，甚至會更危險。

Dogterom表示，人工合成細胞也會帶來倫理和哲學方面的問題，比如它們是生命體嗎？它們是自主的嗎？我們應該控制它們嗎？這一定會在公眾與科研界之間引發爭論。至於這些人造細胞會自由發展、進化，Dogterom倒不是特別擔心，她相信至少第一批人造細胞還不會那麼高級。作為合成生命工程師，她們也可以在人造細胞里加入控制開關，確保安全性。

Dogterom等合成生物學家將繼續她們的工作。她表示，現在時機正好。我們有了人造基因組和其它所有需要的材料。細胞只需要數百個基因就可以存活。雖然幾百個也不是一件容易的事情，但好歹不是幾千個。

原文檢索：

Kendall Powell. (2018) BIOLOGY FROM SCRATCH. Nature, 563: 172-175.

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