腫瘤免疫逃逸新通路

陳列平教授簽名照。圖片由周學迅先生提供

淋巴細胞活化基因3（Lymphocyte-activation gene 3 ,LAG-3, CD223）是一個在活化T細胞上發現的跨膜蛋白，其蛋白質胞外段有4個免疫球蛋白樣結構域 (D1–D4) ，和CD4分子具有較高的同源性【1】。LAG-3主要功能為作為受體傳遞抑制性信號【2】，負調控CD4和CD8 T細胞的增值、活化、效應功能及其穩態【3】。

LAG-3發揮免疫抑制功能的配體是哪一分子，目前尚存在爭議。最初的研究通過細胞與細胞之間的粘附檢測表明MHC-II分子和LAG-3之間存在相互作用【4】。某些LAG-3的單克隆阻斷抗體，比如C9B7W, 是一種特異性抗小鼠LAG-3 D2結構域的單抗，其並不影響LAG-3與MHC-II的結合，但體內與體外的實驗均表明其可以促進T細胞的增值和效應功能【5, 6】。在腫瘤模型中，這種單抗也可以促進腫瘤特異性CD8+T細胞的聚集和效應功能【7】。此外，LAG-3抑制CD8+T細胞和NK細胞的功能也並不依賴與MHC-II分子的相互作用【8】。這些研究表明LAG-3發揮免疫抑制功能，可能是由其他未知配體介導的。

12月21日，耶魯大學陳列平教授團隊（第一作者為王俊博士）在Cell上發表了題為Fibrinogen-like Protein 1 Is a Major Immune Inhibitory Ligand of LAG-3的論文，證明了纖維介素蛋白1(Fibrinogen-like protein 1, FGL1)是LAG-3的一個重要的功能性配體，並揭示了該LAG-3-FGL1通路在腫瘤免疫中的作用。

FGL1屬於纖維蛋白原家族，但它並沒有特徵性的血小板結合位點、凝血酶敏感位點等結構域【9】。在正常生理情況下，肝細胞分泌一定水平的FGL1蛋白，促進肝細胞的有絲分裂及新陳代謝【10】。

本篇研究中，陳列平團隊首先利用他們團隊的Genome-scale receptor array(GSRA) 技術來篩選LAG-3的結合蛋白（圖1）。GSRA是其團隊發明的一套半自動基因表達和檢測系統，用以快速檢測蛋白與蛋白之間的相互作用【11】。該系統以1536孔細胞培養板為載體，分別在293T細胞中過表達人cDNA中的每一種跨膜或分泌蛋白（添加了跨膜結構域）。然後，通過激光掃描和微孔共聚焦熒光識別(the mix-andread laser scanning macro-confocal fluorescent plate reader)，來識別已用Ig標記過的目的蛋白與各種跨膜或分泌蛋白的相互作用，從而實現高通量的篩選。現版本的GSRA可以篩選超過6000種蛋白，大約包括90%的人已有注釋的跨膜和分泌蛋白。

圖1 GSRA篩選LAG-3結合蛋白示意圖

通過GSRA，研究人員發現FGL1是LAG-3-Ig的一個主要結合蛋白。而且FGL1-LAG-3的相互作用在人和小鼠中都存在。研究人員還用流式以及生化實驗進一步證實了兩者的結合。隨後通過結構域刪除實驗，他們發現，FGL1和LGA-3的相互作用不依賴於MHC-II分子，FGL1纖維蛋白原樣結構域和LAG-3的D1-D2結構域對於兩者的結合是至關重要的。再通過一系列的體內與體外實驗，他們也證明了FGL1可以通過LAG-3抑制抗原介導的T細胞反應，進一步證實了FGL1是LAG-3的一個功能性配體。

然後，研究者分別在FGL1基因敲除FGL1-KO和LAG-3基因敲除LAG-3-KO小鼠中構建MC38腫瘤模型。結果顯示，與野生型WT小鼠相比較，LAG-3-KO小鼠和FGL1-KO小鼠中，腫瘤生長速度都較慢。所有的WT小鼠在實驗60天以內達到實驗終點（腫瘤平均直徑達到15毫米），而50%的LAG-3-KO小鼠和FGL1-KO小鼠在接種腫瘤200天後可以達到無瘤生存。同樣地，抗FGL1單克隆抗體和抗LAG-3單克隆抗體，都可以有效地控制小鼠MC38腫瘤模型中腫瘤的生長。相應的，由於缺少T細胞和B細胞，抗FGL1單克隆抗體和抗LAG-3單克隆抗體的抗腫瘤作用在Rag1-KO C57BL/6裸小鼠中完全消失。然後，研究者通過質譜流式細胞儀(CyTOF) 分析了FGL1-KO和WT小鼠腫瘤模型中腫瘤浸潤白細胞(tumor-infiltrating leukocytes,TIL)的表型。結果顯示，與WT相比，FGL1-KO小鼠腫瘤中CD44+ CD62L-PD-1+ Gata3+ CD4+效應記憶T細胞和CD44+ Ly6C+ CD8+記憶T細胞群的比例明顯增加。同時研究人員還發現，和對照組相比較，在抗FGL1單克隆抗體和抗LAG-3單克隆抗體處理的小鼠腫瘤模型中，每微克腫瘤組織中CD45+白細胞、CD8+和CD4+ TIL的絕對數量都有增加。以上表明，在小鼠腫瘤模型中，不論是通過基因敲除還是抗體阻斷，阻斷FGL1-LAG-3相互作用都可以通過刺激腫瘤微環境中T細胞的活化和增值來提高機體對腫瘤的免疫與清除。

之後，研究人員分析了275份非小細胞肺癌(NSCLC)臨床樣品中FGL1的表達情況。他們發現FGL1蛋白主要分布於腫瘤細胞中，腫瘤間質表達較低，在正常肺組織沒有表達。NSCLC組織中FGL1的表達水平呈連續分布，約15%的樣品有較高的表達量，同時高FGL1表達量與明顯降低的5年生存率相關。此外，在另一組隊列研究中，他們發現與健康人相比，NSCLC病人血漿FGL1水平明顯偏高，同時在接受抗PD-1治療後，血漿中FGL1較高的患者擁有更低的總體生存率。相似的結果也可以在另一組接受抗PD-1治療的轉移性黑色素瘤隊列研究中得到。研究人員還在MC38小鼠腫瘤模型中測試了抗FGL1和抗LAG-3在B7-H1-PD-1通路阻抗下的效果，結果表明，單獨使用三種抗FGL1單抗，抗LAG-3單抗， 或抗B7-H1單抗處理是可以延緩腫瘤生長和部分延長生存率，抗FGL1單抗或抗LAG-3單抗和抗B7-H1單抗連用是可以明顯提高小鼠總體生存率，抑制腫瘤生長。以上表明，FGL1-LAG-3相互作用是獨立於B7-H1-PD-1通路的另一條腫瘤免疫逃逸通路，阻斷這條通路能和抗PD-1治療起到協同作用。

總之，本研究發現並證明了FGL1-LAG-3是腫瘤免疫逃逸的一條新通路，且可作為腫瘤免疫治療的潛在靶點。

值得一提的是，陳列平教授今年10月份在Cell上發表了一篇題為A Paradigm Shift in Cancer Immunotherapy: From Enhancement to Normalization的重要綜述，特彆強調了「免疫正常化」的概念最終指導未來腫瘤免疫療法的設計。

關於陳教授近日發表Cell的內容，可以點擊下方視頻觀看陳教授前不久在未來論壇上的現場講座。

原文鏈接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(18)31502-2

參考文獻

1. Triebel, F., et al., LAG-3, a novel lymphocyte activation gene closely related to CD4. J Exp Med, 1990. 171(5): p. 1393-405.

2. Workman, C.J., K.J. Dugger and D.A. Vignali, Cutting edge: molecular analysis of the negative regulatory function of lymphocyte activation gene-3.J Immunol, 2002. 169(10): p. 5392-5.

3. Workman, C.J. and D.A. Vignali, The CD4-related molecule, LAG-3 (CD223), regulates the expansion of activated T cells. Eur J Immunol, 2003. 33(4): p. 970-9.

4. Baixeras, E., et al., Characterization of the lymphocyte activation gene 3-encoded protein. A new ligand for human leukocyte antigen class II antigens.J Exp Med, 1992. 176(2): p. 327-37.

5. Workman, C.J., et al., Lymphocyte activation gene-3 (CD223) regulates the size of the expanding T cell population following antigen activation in vivo. J Immunol, 2004. 172(9): p. 5450-5.

6. Workman, C.J., et al., Phenotypic analysis of the murine CD4-related glycoprotein, CD223 (LAG-3). Eur J Immunol, 2002. 32(8): p. 2255-63.

7. Woo, S.R., et al., Immune inhibitory molecules LAG-3 and PD-1 synergistically regulate T-cell function to promote tumoral immune escape. Cancer Res, 2012. 72(4): p. 917-27.

8. Anderson, A.C., N. Joller and V.K. Kuchroo, Lag-3, Tim-3, and TIGIT: Co-inhibitory Receptors with Specialized Functions in Immune Regulation.Immunity, 2016. 44(5): p. 989-1004.

9. Yamamoto, T., et al., Molecular cloning and initial characterization of a novel fibrinogen-related gene, HFREP-1. Biochem Biophys Res Commun, 1993. 193(2): p. 681-7.

10. Demchev, V., et al., Targeted deletion of fibrinogen like protein 1 reveals a novel role in energy substrate utilization. PLoS One, 2013. 8(3): p. e58084.

11. Yao, S., et al., B7-h2 is a costimulatory ligand for CD28 in human. Immunity, 2011. 34(5): p. 729-40.

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