先進體外診斷，那些必須注意的質量管理問題

前言

頗具規模和影響力的2019（第七屆）先進體外診斷行業峰會將於2019年3月15日至3月16日在上海召開，此次峰會將圍繞國內體外診斷（IVD）產業存在的實際問題和實際需求，設置多個論壇和專場模塊，力求為產業發展提供創新思路和解決方案。大會將邀請來自政府機構、學會的專家，國內外IVD龍頭企業的高層管理者以及國內三甲醫院的臨床檢驗人員，IVD行業知名專家，共同討論IVD各領域法規、產品、市場、模式、技術等多方面的話題。

在這篇文章中，編者認為，原料質量控制、試劑質量管理、標誌物的檢測有效性和臨床有用性、檢驗方法與檢驗程序標準化、試劑標準物質註冊使用均是體外診斷系統質量管理的關鍵內容，下邊編者就為您一一梳理。

質量源於設計

體外診斷試劑 (包括校準品、試劑 、試劑盒 、控制品等）可單獨或與器具、儀器、設備或系統等聯合使用，按體外診斷檢驗程序，對人體樣本進行檢查，檢測樣本中的某個量或測量生物學、化學或免疫學的物質，能夠為醫療診治提供有用信息。一般而言，將完成一個項目檢測所涉及的校準品、試劑、儀器、操作程序、質量控制、操作人員等的組合稱為檢測系統。由此可見，體外診斷試劑具有醫療器械所定義的一般特徵，雖然體外診斷試劑並不會直接接觸人體，其質量缺陷也不會像藥品那樣導致患者身體受到直接損害，但是體外診斷試劑的質量缺陷卻能夠導致診斷的不準確性，進而間接對患者造成傷害，因此體外診斷試劑的質量控制尤為重要。

根據產品生命周期理論，IVD產品的生命周期依然符合以下階段：產品設計開發階段、產品生產轉化階段、產品規模化生產階段、產品質量改進階段（即上市後的再評價階段，但應貫穿整個產品生命周期）。而在產品最初的研發階段，其原始設計便很大程度上決定了IVD產品質量，因此，產品開發階段，應充分做好質量管理，應在研發設計階段充分考慮潛在問題和風險：產品設計方案應該設計好各個開發階段；詳細的階段分化則便於階段質量控制，監視質量形成過程；分階段消除所有階段引起不合格或不滿意效果的因素。研發設計方案應該充分考慮到生產轉化階段的潛在問題和大規模生產有關的潛在風險，並需要提前作出規避策略。

除了產品設計開發階段對質量的把控，產品質量仍然由多種因素所決定：

原料質量控制及試劑質量管理

體外診斷試劑的原料是體外診斷行業的基石。體外診斷產品的質量很大程度上是由上游的試劑原料所決定的。近幾年我國體外診斷試劑行業已從導入期步入發展期，市場需求快速增長，國內IVD原料及試劑生產企業抓住機遇，憑藉其產品自身性價比高和更為貼切本土市場的優勢，不斷搶佔市場份額，使原本以進口產品為主導的原料市場格局被逐漸打破。但由於激烈的行業競爭，部分IVD原料及試劑生產企業為了削減生產成本而選擇降低原料的質量控制，這樣以來便造成了我國目前原料生產行業質量參差不齊的格局。那麼，如何保證IVD原料的高質量和高品質呢？筆者便以抗原/抗體診斷原料的質量控制為例進行闡述。

原料質量控制：包括對於動物源品質的控制、培養基質量的控制、生物安全性檢測等。IVD原料不是簡單的製備蛋白，還需要考慮原料的特異性、靈敏度、批間差、純度等性能。細胞庫的質量控制：抗體診斷原料的製備離不開雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在數次傳代後會出現活力逐步下降現象，若細胞株保存不善受到污染，對抗體原料的影響也很嚴重。因此細胞株科學的凍存、復甦及傳代是非常重要的。

目前，少數的抗原抗體診斷原料生產廠家採用採用體外重組表達的方式獲得IVD原料，保證了原料的純度、批間差等性能。表達系統包括原核表達和哺乳動物表達。生產和純化：抗體原料的生產方式主要分為體內培養和體外培養兩種。體內培養是通過小鼠腹水培養而得，而體外培養則是通過生物反應器而得。由於動物保護問題和動物個體間的潛在差異，體外培養生產抗體可能會成為主要的生產方式。

目前原料的純化方式主要為親和層析和離子交換層析，其中對於單抗而言，主要以protein A/G 的親和層析為主；對於多抗，則以高純度的抗原親和層析為主；對於抗原，多以親和純化的方式。

關於出廠檢測，在《體外診斷試劑生產及質量控制技術指導原則》中對體外診斷試劑原料常規檢測項目進行了概述：1）外觀：肉眼觀察，大部分體外診斷試劑原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉澱或顆粒；或為白色粉末且不含有其他雜質。2）純度和分子量：主要方法是SDS-PAGE電泳後經考馬斯亮藍或者銀染色法進行染色，然後對條帶進行掃描分析。此外，高效液相層析也可以用於純度和分子量測定。作為體外診斷試劑用的IVD原料，用銀染法染色後，純度一般要大於90%；用考馬斯亮藍染色後，純度一般都要大於95%。3）蛋白濃度：主要測定方法為Lowry法、OD280nm光吸收法和雙縮脲法等。需要注意的是，不同方法學之間的結果存在一定差異，因此建議可以採取與原料廠商一致的方法進行驗證。4）抗體效價：效價的測定一般根據擔保含量測定結果，通過倍比稀釋法進行。效價應達到規定的要求。5）功能性：包括特異性、靈敏度、穩定性、批間差、精密度等功能性分析，並比較其與上一批次原料的相關性。

試劑標準物質註冊使用

要使基於體外診斷的臨床檢驗結果可靠可信，通常需要有標準品和質控品的協助。由於純標準液與病人標本的成分（基體）差異較大，引入了校準品代替標準品，但在實際使用中往往忽略校準品的專用性，同時質控品是由基礎材料（來自人或動物的血清或其他體內物質）添加其他材料製備而成，當對被分析物質進行檢驗時，其他成分也有可能影響檢測結果。除此之外，生產廠家對校準品和質控品的來源、穩定性、瓶間差、定值和不定值、分析物水平以及使用前準備的說明和控制程度的不同，也會造成檢驗質量水平的高低差異。

為配合《體外診斷試劑註冊管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第5號）的實施執行，早在2016年，國家便公布了註冊檢驗用體外診斷試劑國家標準品和參考品目錄（圖1-2）。因此，國內體外診斷試劑生產企業在試劑標準物質註冊使用方面便有章可循。

圖1. 第1期檢驗用體外診斷試劑國家標準品和參考品目錄

圖2. 第2期檢驗用體外診斷試劑國家標準品和參考品目錄

標誌物的檢測有效性和臨床有用性

特別是對於定性檢測體外診斷試劑，開展檢測準確性評估是非常有必要的，因為產品性能指標與臨床治療的時機和方案選擇密切相關，所以必須通過分析性能評價，證明產品的安全性和有效性。如果在臨床治療過程中，因為產品出現假陽性、假陰性等錯誤結果造成誤診，那麼在治療成本上產生的代價將是巨大的。

法規及相關指南文件對IVD產品的分析性能評價均作出了具體要求。比如，歐盟IVDR法規在附錄13中，明確規定了體外診斷試劑性能評價的要求；國內NMPA根據《醫療器械註冊管理辦法》要求，結合定性檢測體外診斷試劑產品特點，制定了《定性檢測體外診斷試劑（盒）產品技術審評規範》；此外，CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）也制定了相關指南文件，指導開展性能評價工作。由於不同疾病的病變部位不同，根據不同組織樣本設計的檢測方案以及數據分析過程也會存在很大差異，因此很難制定統一、標準化的實驗細節。但是，建立標準化的分析性能評價流程，是可行的而且是十分有必要的。

總的來說，評價流程可以分為六個步驟：1）明確性能指標及其定義；2）儀器、設備、試劑的熟悉和培訓；3）評價材料：4）再現性研究；5）檢測方法的對比性研究；6）數據分析。

此外，為了保證檢測的有效性，企業檢測實驗室也應制定自己的標準檢測系統，制定由一個或多個工作校準品或計量學上高一級的校準品進行校準的測量方法，選擇校準品的定值和測量的不確定度應由次級參考方法或直接由原級參考方法來定值和估計其不確定度。所使用的參考品應證明在參考測定方法與被校準方法之間有適當的可轉換性。

檢驗方法與檢驗程序標準化

目前，我國尚未出台體外診斷試劑產品技術標準，難以標準化的主要原因是大多數品種尚未建立可靠的參考方法。另外，標準值的建立和定值困難，也是造成體外診斷試劑的難以標準化的原因。以前的老方法與新的自動化方法無可比性，即使使用同樣的抗體和標準物，用手工方法和用全自動方法分析時，也會得到不同的結果。在生物體液中可有異源性的抗原物質，標本中常含有蛋白質前體、剪接的變化、碎片及被分析物的複合物形式存在，多數激素和腫瘤標誌物還有內在的異質物，使得標準品和被分析物很難有一致的基質，造成標準品難以獲得。

談到標準化，則一定會提到ISO，為確保患者的治療安全與測試準確，確保體外診斷試劑的質量安全與相關標準達到國內或國際規定的要求。ISO9001 是國際標準化組織(ISO)於 1987 年頒布的在全世界範圍內通用的關於質量管理和質量保證方面的系列標準，是 ISO9000 族標準所包括的一組質量管理體系核心標準之一。因此，體外診斷試劑生產企業應確保產品的檢驗方法與檢驗程序符合ISO標準。

此外，由於體外診斷試劑產品的生物學及化學本質，生產過程中環境的細菌狀況、溫濕度條件、儲存條件和時間、操作過程以及包裝、運輸過程都有可能對試劑的性能產生影響，這對試劑生產企業的管理提出相當高的要求。在質量體系考核中，部分體外診斷試劑生產企業質量管理部門定期對每批產品質控指標的檢驗數據進行分析匯總，編製質量曲線，從而監控產品批間差和批內差，不但能夠清楚地反映企業產品質量性能的波動狀況，還有利於採取及時有效的糾正和預防措施，保證體系持續有效。

總結

體外診斷試劑的質量管理關係這臨床診斷的有效性和準確性，其重要性不言而喻。體外診斷企業應著重從原料質量控制、試劑質量管理、標誌物的檢測有效性和臨床有用性、檢驗方法與檢驗程序標準化、試劑標準物質註冊使用等方面嚴格把關體外診斷試劑的質量。以上便是編者對體外診斷試劑的質量管理的種種思考，預知更多細節和內容，請密切關注即將召開的2019（第七屆）先進體外診斷行業峰會，相信您會收穫更多。

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