外泌體與腫瘤細胞轉移及惡化的關聯

導語：生物谷將於2019年4月19-20日舉辦2019（第四屆）外泌體與疾病研討會。

來源：梅斯醫學

腫瘤的形成和惡化過程不僅與腫瘤細胞彼此間的相互作用有關，還和腫瘤細胞和正常細胞所構成微環境的相互作用有關。例如，從很早開始科學家們就觀察，在很多的腫瘤組織中浸潤著正常的免疫細胞，而臨床認為慢性炎症會增加產生腫瘤的風險。此外，有報告顯示成纖維細胞和內皮細胞等細胞構成的腫瘤微環境，有助於腫瘤細胞的增殖。

大多數以根治腫瘤細胞為目標的治療方法，不僅對正常細胞有很強的毒性，其副作用還會對身體產生極大的負擔。而且，由於染色體不穩定的腫瘤細胞容易獲得耐藥性，病情反覆發作時藥物無效也是一個很大的問題。對此，破壞由正常細胞構成的微環境又或者對其進行適當的控制來根治腫瘤的治療策略備受矚目[1]。

本文對細胞外泌體和腫瘤細胞轉移及其惡化的關聯進行了介紹，同時也對Epstein-Barr病毒（EBV）陽性惡性淋巴瘤中外泌體的活動情況進行了概述。

細胞外囊泡外泌體是什麼？

生物體內所有的細胞都是通過直接接觸或者細胞因子、趨化因子等分泌蛋白來進行信息傳遞的。近年來，作為擔任這種細胞間信息傳遞的新因子，細胞外囊泡受到了大家的關注。科學家發現，細胞外囊泡和細胞一樣，由脂質雙層膜構成，包含蛋白，核酸、脂質等多種物質，同時細胞外囊泡還能傳遞這些分子中包含的信息[2]。

外泌體是細胞外囊泡中直徑較小(50~200nm)，從核內體的多胞體（MVB:multi-vesicular body）中釋放而出。以前通常採用超速離心法或者密度梯度離心法來分離外泌體，但是採用這些方法很難完全去除外泌體中來自細胞本身的雜質。為了更進一步地研究外泌體，我們一直在尋找能分離出更高純度外泌體的方法。作者利用和光純葯研發的新型外泌體提取試劑盒，嘗試進行了外泌體的分離實驗。該試劑盒中的試劑能夠親和外泌體表面的磷酯醯絲氨酸,從而實現外泌體的分離。用以前的超離心方法分離出的外泌體和使用本試劑盒分離出的外泌體在電子顯微鏡下觀察圖像如圖1所示。使用超離心法提取的外泌體中混入了很多雜質，使用本試劑盒則成功分離出高純度的外泌體。我們期待今後這種親和提取方法能成為一種分離外泌體的標準方法。

圖1.使用不同分離法時外泌體純度的比較

外泌體和腫瘤的轉移和惡化

自2007年發現外泌體中含有miRNA後[3]，科學家開展了很多通過外泌體進行生物分子運輸和其生物學意義的研究。特別是根據「腫瘤細胞會分泌更多的外泌體」、「外泌體中含有腫瘤特異性抗原，而外泌體能運輸這些抗原」等的研究，外泌體作為一種新的診斷和治療的靶標受到廣泛的關注。為了顯示腫瘤外泌體在微環境中的活動會促使腫瘤轉移和惡化，本文將為大家介紹幾個相關研究成果。

腫瘤在轉移到其他組織時，需要在間質細胞間移動併到達血管中。科學家們發現，在這個過程中，外泌體通過纖維連接蛋白促進腫瘤細胞的運動性，再通過MT1-MMP蛋白酶促進細胞外基質的分解、血管新生及血管滲透性，來促進腫瘤轉移4-[7]。此外，還發現了多數的腫瘤細胞對轉移的組織具有指向性，而外泌體表面的整合素就是決定其指向性的因子。這些報道表明，αvβ5整合素決定了對肝臟、α6β4·α6β1整合素決定了對肺部的指向性[8]。這些報告是以外泌體為中心的腫瘤細胞-微環境之間複雜交流極其重要的報告。

在上述報導的基礎上，以下是作者團隊獨自就EBV陽性淋巴瘤中外泌體作用進行研究的概述。

Epstein-Barr病毒（EBV）和惡性淋巴瘤

Epstein-Barr病毒（EBV）是從Burkitt淋巴瘤培養細胞中分離的最初的人體癌症病毒。CD21被認定為感染性受體，在試管中容易引起B細胞的轉化。由此我們知道EBV編碼的LMP（latent membrane protein）及 EBNA （EBV nuclear antigen）等9種基因控制了細胞內信號和轉錄因子的活性，導致了感染細胞的永生化和形態轉化。

現在，世界上90%的人口都攜帶EBV，即處於潛伏感染狀態，當由於各種各樣的原因導致免疫力低下時，會引發B細胞性·T/NK細胞性淋巴瘤，極少數情況下還會引發鼻咽癌或胃癌等上皮細胞腫瘤。有報告顯示在部分的B細胞性淋巴瘤里，用傳統的方法進行治療時，EBV呈陽性的病例比EBV呈陰性的病例治療效果差，出現預後不良。人們強烈希望研發出針對EBV陽性淋巴瘤、替代現有治療方法的特效新療法。作者鑒於EBV陽性疾病治療的現狀，以EBV陽性淋巴瘤的發病及惡化的機製為核心進行了研究。

重要的一點是，EBV陽性淋巴瘤組織中浸潤了很多免疫細胞，而腫瘤細胞依靠炎症微環境來生存。作者著眼於這點，對EBV陽性淋巴瘤外泌體對微環境的影響以及作為促進淋巴瘤惡化因子的EBV源miRNA活動情況進行了分析。

外泌體運送EBV來源的miRNA

EBV自身的染色體組上被稱為BART（BamHI-A rightward transcripts）的領域裡有編碼miRNA簇。這個簇中編碼了大約40種的miRNA，也有人稱之為BART miRNA，本文統一稱為EBV miRNA。現在，這些EBV miRNA在淋巴瘤發病和惡化中的作用還存在很大的爭論。例如，有研究顯示EBV miRNA抑制細胞凋亡有助於腫瘤生存，也有研究報道顯示維持EBV的潛伏狀態可以抑制腫瘤化9）。

在此類研究中，Pegtel團隊的研究發現，EBV陽性淋巴瘤細胞分泌出的外泌體中含有EBV miRNA10）。這份報告表明了外泌體選擇性進入人單核細胞來源的樹突狀細胞（MoDC），並運送EBV miRNA。從該結果可知，EBV陽性淋巴瘤中的外泌體對腫瘤組織中浸潤的非腫瘤細胞的活性有一定影響，還能導致微環境的改變。

外泌體對淋巴瘤發病的影響

在Pegtel團隊的研究的基礎上，作者嘗試進行同樣的實驗時，證實了淋巴瘤中的外泌體會選擇性進入單核細胞/巨噬細胞。我們發現含有大量EBV miRNA的外泌體能促進巨噬細胞中TNFα和IL-10等基因的表達。這種基因的表達模式和在腫瘤微環境中浸潤的TAM（Tumor-associated macrophage）非常相似，所以吸收含有EBV miRNA的外泌體的巨噬細胞可能在微環境的構成中發揮重要的功能。

接著，為了確認EBV陽性淋巴瘤中的外泌體能促進微環境構建，作者利用了EBV感染的小鼠模型。本來，EBV只會感染以人類為首的靈長類動物，但將人類臍帶血中CD34陽性造血幹細胞移植到免疫缺陷NOG小鼠上，如此可建立由EBV感染引發的淋巴瘤發病的小鼠模型。這個小鼠模型在被野生型EBV株（Akata）和EBV miRNA缺損株（B95-8）感染後，感染野生型株的小鼠預後較差，但感染miRNA缺損株的小鼠恢復情況良好。對此，作者嘗試對感染miRNA缺損株的小鼠靜脈注射含有miRNA的外泌體，發現小鼠竟然產生了淋巴瘤，而且腫瘤組織中浸潤著大量的巨噬細胞。最後我們還發現，注入氯膦酸鹽脂質體去除腫瘤中巨噬細胞的同時，腫瘤細胞也會減少。

上述結果表明，在EBV陽性淋巴瘤惡化的過程中，外泌體能利用巨噬細胞構建有利於腫瘤細胞的微環境。

結語

外泌體在剛被發現時，曾被認為是把多餘的蛋白和核酸釋放到細胞外的一種結構。但如今作為診斷和治療以腫瘤為主的各種疾病的靶標而備受關注。本文著重介紹了腫瘤中外泌體的功能，並認為外泌體會參與到所有的生命現象中。雖然大多數的研究都已明確了外泌體的生物學意義，但其詳細的功能還存在很多未知的部分。希望我們的研究能有助於今後對外泌體的研究。

作者：東海大學綜合醫學研究所造血領域 東海大學醫學部血液腫瘤內科 樋口廣士、幸谷愛

推薦會議：2019（第四屆）外泌體與疾病研討會

時間：2019年4月19-20日

地點：上海

主辦方：生物谷

聯繫人：彭凡

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【參考文獻】

1） Quail, D. F. and Joyce, J. A. : Nat. Med ., 19 （11）, 1423（2013）.

2） Tkach, M. and Thery, C. : Cell , 164, 1226 （2016）.

3） Valadi, H. et al . : Nat. Cell Biol ., 9（6）, 654 （2007）.

4） Sung, B. H. et al . : Nat. Commun ., 6, 7164 （2015）.

5） Hoshino, D. et al . : Cell Rep ., 5, 1159（ 2013）.

6） Kosaka, N. et al . : J. Biol. Chem ., 285（ 23）, 17442（ 2010）.

7） Zhou, W. et al . : Cancer Cell , 25, 501（ 2014）.

8） Hoshino, A. et al . : Nature , 527, 329（ 2015）.

9） Ok, C. Y. et al . : Blood , 122（ 3）, 328（ 2013）.

10） Pegtel, D. M. et al . : PNAS , 107（ 14）, 6328 （2010）.

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