科學家建立食氣梭菌大片段基因簇染色體整合表達新技術

2019年1月8日，國際學術期刊Metabolic Engineering在線發表了中國科學院分子植物科學卓越創新中心/植物生理生態研究所姜衛紅研究組題為Phage serine integrase-mediated genome engineering for efficient expression of chemical biosynthetic pathway in gas-fermenting Clostridium ljungdahlii的論文。該研究在化能自養型一碳氣體利用菌——食氣梭菌中建立了一種基於噬菌體位點特異性重組機制的大片段基因簇染色體整合表達的新技術，為新型一碳氣體化能細胞工廠的創建和研究提供了有用的遺傳操作工具。

一碳氣體（如CO2、CO）是儲量巨大的遊離性碳資源。近年來，為了拓展它們的利用途徑並大力發展綠色生物製造，通過生物轉化一碳氣體以合成各類化學品和能源物質的技術路線受到廣泛關注。迄今已知的可利用一碳氣體的微生物按能量需求主要可分為化學能、光能以及電能自養等類型。食氣梭菌是一類主要的化能自養菌，以氫氣或其他還原性化合物作為能量供體，其氣體發酵過程與傳統工業發酵設備的匹配性較好，具有良好的應用前景。然而，食氣梭菌的天然產物種類少，發酵單位較低且遺傳操作困難。因此，亟待發展高效的分子技術平台，用於其代謝工程設計、改造以及合成生物學研究，進而創建更為高效和產物多樣化的人工固碳體系，實現一碳氣體生物轉化利用能力的提升。

為構建高效且產物多樣化的食氣梭菌細胞工廠，無論是天然產物的強化合成，還是異源途徑的適配表達，大片段代謝途徑基因簇在染色體上的高效整合與編輯都是必須用到的有效策略，其遺傳穩定性顯著優於藉助遊離性質粒載體的方法。2016年，姜衛紅研究組率先在食氣梭菌Clostridium ljungdahlii中建立了CRISPR-Cas9介導的基因組編輯技術（Huang et al.,ACS Synth Biol,2016）。該技術可用於食氣梭菌染色體上基因的刪除或小片段DNA在染色體上的整合，但受限於較低的同源重組效率，並不能實現在染色體上通過重組機制引入大片段目標產物合成基因簇的目的。為解決上述難題，該研究首先藉助於CRISPR-Cas9基因編輯系統，在食氣梭菌染色體上整合了來自於兩套異源噬菌體整合系統的attB位點。在此基礎上，通過整合酶介導的attP-attB重組機制實現了外源基因簇在染色體上任一attB位點的高效插入（100%），從而實現新產物的合成。此外，新方法還通過基於「雙整合酶-雙attP/attB」策略的兩次重組以及CRISPR-Cas9定向切割的篩選作用，實現了特定目標基因簇在染色體上的整合，解決了使用單套attP/attB系統時引入其他「雜質DNA」的缺陷，從而確保基因簇的穩定表達。最終，作者在食氣梭菌Clostridium ljungdahlii的染色體上成功整合了來源於丙酮丁醇梭菌的丁酸合成基因簇。在單批氣體發酵中，工程菌的丁酸產量達到1.01 g/L，其產物濃度和合成速率均高於已報道的食氣梭菌，且經過10餘代次的連續培養仍能保持這一發酵水平，顯示了良好的遺傳穩定性。

上述研究結果彌補了現有食氣梭菌遺傳操作方法的不足，為這一重要工業微生物的多樣化細胞工廠的構建提供了極大便利。此外，由於噬菌體位點特異性重組系統廣泛分布且具有一定的普適性，該方法也可拓展到其他梭菌或固碳微生物的改造中，從而有效加速一碳氣體生物轉化利用的應用研究。

副研究員黃鶴為該論文的第一作者，研究員顧陽為共同通訊作者。該研究獲得國家自然科學基金、上海市科委「科技創新行動計劃」基礎研究領域項目、中科院青年創新促進會等資助。

圖：基於噬菌體特異性整合系統的食氣梭菌外源DNA染色體插入技術

來源：中國科學院分子植物科學卓越創新中心/中國科學院植物生理生態研究所

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