作物基因組編輯的國際態勢
本文對作物基因組編輯技術的研發現狀、重要國家、重要機構和研究主題進行分析，旨在了解全球作物基因組編輯技術的發展和應用現狀，以期為我國相關領域的研發布局和決策提供參考依據。
基因組編輯技術作為一項重要的新興前沿技術，已在生命科學基礎理論研究、經濟物種的遺傳改良以及人類健康等領域得到廣泛應用，掀起了一場顛覆性的革命。
2012和2013年, Science分別將TALEN和CRISPR/Cas9技術評為年度世界十大科學進展之一； 2014年, Nature methods將基因組編輯技術評為近十年中對生物學研究最有影響力的方法之一； 2015年, Science將CRISPR/Cas9技術評為2015年十大科學突破之首； 2016年，麻省理工科技評論將植物基因精準編輯技術列為當年的十大突破技術； 2017年, Science將單鹼基基因編輯技術評為十大突破之一。
目前，基因組編輯技術在模式植物或作物的基礎研究中得到廣泛應用，一些利用這些技術研發的作物品種也已獲得商業化許可，預計未來幾年基因組編輯作物品種將在全球範圍內快速發展。 由於基因組編輯技術顯示出巨大優勢，農業跨國企業紛紛調整戰略布局，加大相關領域的各項投入，力圖佔領基因組編輯技術在農業領域發展和應用的主導地位。
在此背景下，本文對作物基因組編輯技術的研發現狀、重要國家、重要機構和研究主題進行分析，旨在了解全球作物基因組編輯技術的發展和應用現狀，以期為我國相關領域的研發布局和決策提供參考依據。
一、作物基因組編輯技術基礎研究情況分析
1.1 研究論文發文數量年度變化趨勢
圖 1 作物基因組編輯技術文獻年度分布
1993~2008年為起始階段。此時，作物基因組編輯技術的相關研究論文數量較少，發文量均小於10篇。 作物基因組編輯相關研究的首篇文章由法國巴斯德研究所的研究人員發表於1993年，涉及I-SceI誘導的雙鏈DNA斷裂可以提高煙草同源重組頻率等內容，掀開了利用序列特異性核酸酶開展作物基因組精準操作時代的序幕。
2009~2012年為緩慢發展階段。在此期間，作物基因組編輯技術相關研究的發文量緩慢增長。 相對而言，ZFN技術的發文數量較多，如2011年的最高發文量達到36篇，為該階段研究較熱的基因組編輯技術。
2013年至今為技術快速發展階段。在此階段，CRISPR/Cas9技術發展迅猛，其發文量呈指數增長趨勢，2017年的發文量比2013年的發文量增長了近16倍。 2013年，美國麻省總醫院、塞恩斯伯里實驗室和中國科學院等機構的研究人員分別利用CRISPR/Cas9技術在雙子葉植物擬南芥、煙草及單子葉植物水稻、小麥中進行基因組修飾。 此後，世界各國研究人員開始聚焦這個新的研究領域，掀起了新一代基因組編輯的狂潮。
1.2 四種分支技術的研究論文數量分析
從作物基因組編輯技術各分支技術的文獻數量來看(圖2)，CRISPR相關研究的文獻量最多，共447篇，佔總量的36.14%； 其次為ZFN技術，其相關研究的文獻量為387篇，佔總量的31.29%； 文獻量排第三的為TALEN技術，有286篇，佔總量的23.12%； 文獻量最少的為MN技術，有147篇，佔總量的11.80%。
圖 2 作物基因組編輯技術文獻量對比, 各分支的文獻之間有少量重疊
1.3 研究主題分析
作物基因組編輯技術研究主題演化結果如圖3所示。
圖 3 作物基因組編輯技術熱點年度分布
1993~2000年，相關研究熱點主要集中在MN技術的作用原理或機制及其在作物中應用等。例如，研究發現來自釀酒酵母的I-SceI核酸內切酶可以誘導DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break，DSB)，可使同源重組頻率提高几個數量級； 此外，將目標載體通過農桿菌介導的方法在擬南芥、玉米等作物中進行穩定遺傳轉化，研究MN技術的功效也是研究熱點之一。
2001~2009年，鋅指核酸酶(ZEN)的研究最為活躍，基因組編輯技術的作用機制研究進一步深入，包括雙鏈斷裂機制、同源重組和晶體結構的研究； 此時，基因組編輯技術也經歷了從在模式作物中研究基因表達轉變為在水稻等主要作物中基因突變的功能研究。
2010~2017年期間，TALEN和CRISPR技術相繼出現，基因組編輯技術尤其是CRISPR/Cas9的優化改造和靶向誘變成為該時期的研究熱點，具體內容包括對基因組編輯系統中的組成部分，如核酸酶、DNA結合特異性、III型效應子等改進研究，以增強識別特異性。
1.4 重要國家分析
從發文量年度變化趨勢上來看(圖4)，以美國為代表的歐美髮達國家在該領域具有較強的領先優勢，我國後續發展迅速。法國於1993年最早發表了作物基因組編輯技術相關的研究論文，但其後續研究論文數量增長較為緩慢。美國自1996年開始開展了相關領域的研究，此後發文量呈快速增長趨勢，並且位居全球前列。日本和德國分別在1997和1998年開始進行相關研究，但是後續研究發文量增長緩慢。我國自2003年開始從事該領域的研究，儘管研究起步較晚，但是後續發展快速，2013年後的發文量幾乎呈指數增長，並超越德國、法國和日本，2017年首次超過美國，成為該領域年度發文最多的國家。
圖 4 基因組編輯技術發文量年度變化趨勢
從國家合作情況看，TOP20國家合作緊密，形成了一個來往密集的合作網路，其中方框大小代表發文量的多少，箭頭粗細代表共同合作文章的密切程度(圖5)。 美國處於重要位置，與多個國家均有合作研究。 其中，美國與中國合作論文的數量最多(75篇)，且主要集中在2011~2017年，研究內容涉及CRISPR-Cas9系統、CRISPR-Cpf1系統和基因沉默等方向。 此外，美國和法國的合作研究也較多，共同發表了19篇研究論文，主要集中在2005~2016年，研究內容涉及TALEN鑒定工具、多重靶向基因組編輯、雙向轉錄和阻遏系統等方向。
圖 5 作物基因組編輯技術發文TOP20國家合作網路
從發文量排名TOP10國家的四個分支文獻量分布來看(圖6)，美國、德國和法國在4種基因組編輯技術的布局較為均衡，其他國家則有所側重。 其中，中國、日本、英國和韓國偏重在CRISPR技術領域，印度和澳大利亞偏重在ZFN技術領域，加拿大偏重在MN技術領域。
圖 6 作物基因組編輯技術文獻量排名TOP10國家的技術分布
1.5 重要機構分析
從發文量排名TOP20機構來看(圖7)，作物基因組編輯技術的基礎研究主要以科研機構和大學為主。 其中，中國科學院(78篇)、愛荷華州立大學(54篇)和明尼蘇達大學(48篇)的發文數量位居全球前三位； 排第四位和第五位的分別是中國農業科學院(30篇)和馬普協會(28篇)。 儘管中國科學院、美國愛荷華州立大學和明尼蘇達大學等機構在作物基因組編輯技術領域的基礎研究具有明顯優勢，但是其側重的技術分支各不相同。 其中，中國科學院在CRISPR，TALEN和ZFN上均開展了相關研究，但是側重於CRISPR領域，其近年來主要圍繞CRISPR和TALEN技術在水稻等作物中的應用開展相關研究。 愛荷華州立大學和明尼蘇達大學以合作方式發表了多篇基因組編輯相關的研究論文，是最早從事TALEN技術研究的機構之一，在TALEN等技術上具有領先優勢。
圖 7 作物基因組編輯技術發文TOP20機構分析
從合作關係上看(圖8)，TOP20機構合作彼此緊密，中國科學院與美國普渡大學的合作數量最多(15篇)，且主要集中在2013~2017年，研究內容涉及CRISPR/Cas系統、CRISPR-Cpf1系統、diRNAs和轉錄因子等。 愛荷華州立大學、明尼蘇達大學、哈佛大學、內布拉斯加大學和加州大學戴維斯分校等美國大學之間的合作關係也較為密切，主要涉及遺傳轉化、轉錄激活因子、定向誘變和CRISPR-Cpf1系統等內容。 此外，日本國家農業生物科學研究所和日本橫濱市立大學的合作關係較為密切，雙方在2010~2016年期間共發表了15篇研究論文，主要研究TALEN介導靶向突變、精準定向突變和CRISPR/Cas系統等。
圖 8 作物基因組編輯技術發文TOP20機構合作網路
二、作物基因組編輯技術的技術研發現狀
2.1 四種分支技術的專利數量分布情況
從作物基因組編輯技術專利數量分布來看(圖9)，CRISPR技術的專利數量最多，達1259件，佔總量的46。68%； 其次為MN技術，其專利數量達1104件，佔總量的40。93%； ZFN技術的專利數量排名第三，為978件，佔總量的36。26%； 專利量最少的為TALEN技術，達751件，佔總量的27。85%(各分支的專利之間有少量重疊)。
圖 9 作物基因組編輯技術專利數量對比
2.2 作物基因組編輯技術的重要發展歷程
作物基因組編輯技術發展歷程如圖10所示。其中，MN技術的核心專利出現時間較早，集中分布在2002~2010年，並且近年來相關核心專利不再出現。MN技術核心專利主要掌握在拜耳、Cellectis和巴斯夫等公司手中，相關內容主要涉及利用歸巢核酸酶進行精確的基因組重編程並開發出工業化生產核酸酶的方法、在預期位點修飾作物基因組的方法和通過同源重組對DNA實現靶向誘變等。
圖 10 作物基因組編輯核心技術發展歷程
ZFN核心專利集中分布在2003~2008年，近年來未見該領域的核心專利出現。 目前，ZFN技術主要被Sangamo公司掌控，內容涉及利用鋅指核酸酶提高同源重組的方法、利用改造的鋅指蛋白調控作物內源基因表達等。
TALEN核心專利主要分布在2009~2012年，此後無相關核心專利出現。 目前，該技術主要掌握在2Blades、明尼蘇達大學和愛荷華州立大學等公益性機構手中，並已被授權於多個農業領域領軍企業，如拜耳、杜邦先鋒和孟山都等。 相關核心專利主要涉及TALEN技術的研發、利用TAL效應子的重複結構域選擇性識別靶向DNA序列的方法等。
CRISPR技術核心專利自2013年後才出現，時間最晚，主要集中在Broad研究所、加州大學、哈佛大學和CRISPR Therapeutics等機構，技術內容涉及CRISPR-Cas載體系統和RNA直接靶向DNA修飾調控轉錄的方法、調控多種靶向核酸以及新的單分子嚮導RNA等方法、對新型的CRISPR酶及相關體系的研究等。目前，有關CRISPR基因組編輯技術專利權歸屬上仍存在諸多爭議。其中，Broad研究所獲得美國的專利授權，加州大學伯克利分校獲得中國和歐洲的專利授權，Cellectis等其他多方也聲稱擁有CRISPR的專利權。
2.3 技術研發內容分析
專利研發主題的分析表明，作物基因組編輯技術研發主要涉及基因組編輯技術的方法和應用兩大方面(圖11)。其中，紅色圓圈代表基因組編輯技術相關的方法，如CRISPR，TALEN和ZFN等技術，技術熱點涉及利用CRISPR技術靶向修飾位點、CRISPR核酸酶突變體、VI型CRISPR-Cas系統研究等。藍色圓圈代表基因組編輯技術相關的應用，熱點涉及基因組編輯技術應用於雄性不育、抗逆性和抗除草劑等作物重要農藝性狀改良研究。
圖 11 作物基因組編輯技術專利主題分布全景圖
2.4 重要國家分析
作物基因組編輯專利申請數量排名前10位的國家依次為:美國、法國、中國、德國、日本、比利時、瑞士、荷蘭、韓國和英國(圖12)。 其中，美國的專利數量最多，達1088件，遙遙領先於其他國家。 中國的專利申請數量排名第三位，達225件。 從技術分支上看(圖13)，美國在4種不同的基因組編輯技術的布局較為均衡，且每類技術專利數量均排名第一；中國則偏重在CRISPR技術領域；法國和英國偏重在TALEN技術領域；德國和韓國偏重在MN技術領域。
圖 12 作物基因組編輯技術專利TOP10申請國家
圖 13 作物基因組編輯技術專利數量TOP10國家的技術分布
2.5 重要專利申請機構分析
從專利數量排名TOP20機構來看(圖14)，作物基因組編輯技術的專利申請機構主要來自美國、德國、法國、中國、奧利地和以色列五個國家，並且相關專利申請以企業為主。法國Cellectis公司(280件)、美國陶氏益農公司(256件)和Sangamo公司(184件)的專利數量位居全球前三位，在該領域處於領先優勢。 其中，Cellectis的技術研發主要集中在MN技術，陶氏益農的技術研發主要集中在ZFN，CRISPR和MN技術，Sangamo公司則集中在ZFN和MN等技術的研發與應用。
圖 14 作物基因組編輯技術TOP20專利申請機構
從合作關係上看(圖15)，除加州大學和維也納大學外，主要專利申請機構的合作網路主要以本國國內機構為主，合作多以「小團體」形式體現。 其中，美國陶氏益農、Sangamo公司和Sigma-Aldrich公司之間，哈佛大學、麻省理工學院和Broad研究所之間，明尼蘇達大學和愛荷華州立大學之間各形成3個合作團體。 陶氏益農和Sangamo公司之間合作最頻繁，雙方在2008~2017年期間共申請84件專利，研究內容涉及鋅指蛋白、靶向修飾及整合外源序列的方法和組合物等。
圖 15 作物基因組編輯技術TOP20專利申請機構合作網路
三、作物基因組編輯技術的行業發展現狀
3.1 農業跨國公司非常重視基因組編輯在作物育種中的應用
作物育種是基因組編輯技術最重要的應用之一，目前多數重要農業跨國企業通過技術轉讓和合作方式紛紛進入該領域，以期在未來利用基因組編輯技術進行農作物品種改良中能佔有一席之地。 2015年，杜邦先鋒宣布與維爾紐斯大學簽署指導性Cas9基因組編輯技術的許可及多年的研發合作協議，並獲得該大學商用(包括農用)知識產權的獨家許可。 同年，杜邦與CRISPR/Cas技術領先開發商Caribou生物科學公司達成戰略聯盟，獲得CRISPR/Cas技術在主要農作物中的獨家知識產權使用權。 2017年，孟山都宣布和ToolGen公司就CRISPR技術平台在農業領域的應用達成全球許可協議，並將ToolGen的CRISPR技術平台整合到孟山都的技術平台中，進一步擴大其可用於開發先進作物的基因組編輯工具組合。 2018年，農業科技公司Benson Hill Biosystems (Benson Hill)新的基因組編輯方法獲美國專利商標局的專利授權，該專利涉及CRISPR 3.0 Cms1基因組編輯核酸酶，並將進一步擴大該公司的基因組學工具組合。 同年，孟山都和農業創業公司Pairwise Plant(Pairwise)宣布達成研發合作協議，雙方將通過基因組編輯技術推動農業創新。
3.2 基因組編輯作物商業化產品預計2020年上市
目前，基因組編輯技術已經應用於育種實踐，並培育出多個作物新品種(品系)，其中一些品種已申請解除轉基因管制。 拜耳公司的科學家已利用該技術培育出了具有抗蟲性和抗除草劑的棉花品系，未來該技術還可以用於水稻和大豆品種的改良。 杜邦公司已經獲得了CRISPR技術編輯的玉米和小麥新品系，並將開展相關的大田試驗，並預計到2020年底將會出售用CRISPR技術編輯的種子，其中基於CRISPR-Cas育種技術研製的糯玉米雜交品種已經進入了現場追蹤和監管審查階段。中國科學院遺傳與發育生物學研究所利用基因組編輯技術，首次對六倍體小麥中的MLO基因3個拷貝同時進行了突變，成功獲得了對白粉病具有持久和廣譜抗性的小麥材料(遺傳發育所植物基因編輯技術入選麻省理工科技評論2016年十大技術突破)。Cellectis和陶氏益農等公司分別利用了TALEN和ZFN等技術培育出馬鈴薯和玉米新品種，並被美國農業部宣布解除轉基因生物安全監管。 賓夕法尼亞州立大學利用CRISPR/Cas9技術研發出具有抗褐變能力的雙孢菇，獲得美國農業部監管的豁免權。
四、總結與展望
4.1 總結
基因組編輯技術近年來發展迅猛，尤其是TALEN和CRISPR技術相繼出現，相關研究的科學論文和專利文獻出現井噴式增長，掀起了一股全球基因組編輯研究與應用的高潮。隨著技術的不斷發展和更替，基因組編輯的研究主題也相應地發生了變化:MN技術的研究逐漸衰弱，CRISPR研究不斷升溫；相關研究內容已從生物學機制轉向了編輯功能的應用，研究對象也從煙草、擬南芥等模式植物轉向水稻、小麥、大麥等重要農作物。同時，基因組編輯技術已經應用於育種實踐，並培育出多個作物新品種(品系)，其中一些品種已申請解除轉基因監管。多數重要農業跨國企業通過技術轉讓和合作方式紛紛進入該領域，以期在未來利用基因組編輯技術進行農作物品種改良中能佔有一席之地。
以美國、法國和德國為代表的歐美髮達國家是作物基因組編輯技術的發源地，在這一領域具有較強的領先優勢，其論文數量和專利申請量均遙遙領先於其他國家。 其中，該領域的基礎研究主要以科研機構和大學為主，多數機構之間合作往來密切，中國科學院、美國愛荷華州立大學和明尼蘇達大學等機構是主要的研究論文產出機構。 該領域技術研發則以企業為主，機構合作的開展僅局限於「小團體」之間，Cellectis、陶氏益農和Sangamo是主要的專利申請機構。
我國在作物基因組編輯技術領域的研究雖然起步相對較晚，但是後續發展快速，發文量於2017年首次超過美國，成為該領域年度發文最多的國家。 其中，中國科學院的研究論文數量位居全球首位，表現較為突出，在作物基因組編輯技術領域的基礎研究具有明顯優勢。
4.2 展望
杜邦先鋒、陶氏益農和孟山都等跨國公司在基因組編輯技術的產業化發展進程中起到一定的引領和推動作用，主要通過與基因組編輯主要研發者的技術轉讓和合作方式紛紛進入該領域，並利用CRISPR等最新基因組編輯技術獲得了玉米和小麥等作物新品種，以期在未來利用基因組編輯技術進行農作物品種改良中能佔有一席之地。
我國應當加強創建具有自主知識產權的基因組編輯技術。儘管我國近年來在基因組編輯研究中取得了較大進步，論文數量和專利數量分別位居全球第二位和第三位，但由於現有的基因組編輯技術的核心專利基本被國外機構所壟斷，相關產業發展仍受制於人，因此，我國未來亟需在相關領域創建具有自主知識產權的原始創性成果和核心技術。
轉自丨基因農業網
作者丨李東巧 楊艷萍
研究所簡介
國際技術經濟研究所（IITE）成立於1985年11月，是隸屬於國務院發展研究中心的非營利性研究機構，主要職能是研究我國經濟、科技社會發展中的重大政策性、戰略性、前瞻性問題，跟蹤和分析世界科技、經濟發展態勢，為中央和有關部委提供決策諮詢服務。「全球技術地圖」為國際技術經濟研究所官方微信賬號，致力於向公眾傳遞前沿技術資訊和科技創新洞見。
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