當細胞如玻璃般清透：前所未有精細度繪製小鼠大腦

　　文章來源： Nature自然科研

　　原文作者：Michael Eisenstein

　　現有技術可使組織像玻璃一樣清晰透明並將其膨脹至其原始尺寸的數倍，這為窺探生物系統的內部運作提供了前所未有的機會。

　　2018年3月，日本的研究人員以前所未有的精細度繪製了小鼠大腦的細胞組成。

　　日本RIKEN生物系統動力學研究中心的系統生物學家上田泰己及其團隊，使用一種名為CUBIC-X的技術，繪製了一張小鼠大腦圖譜。他們採用化學方法標記了大腦中的每個細胞，然後在將大腦透明化的同時將其尺寸擴大了十倍。隨後他們利用精密的成像技術對神經元進行了三維重建，據上田泰己介紹，總計約7200萬個細胞。

　　這張3D圖像顯示了經過組織清除的8周人體胚胎的周圍神經（綠色）。 　　圖片來源：Alain Chédotal/Morgane Belle

　　所得圖譜將大腦縮小為一個簡潔的細胞位置資料庫，研究團隊可以根據這個資料庫研究發育過程中不同大腦區域具體發生的變化。未來，這個資料庫還可以推動對特定大腦結構，譬如控制睡眠-覺醒周期等行為的區域，進行更深入的探索。

　　這類方法的工具箱正在不斷擴大，CUBIC-X只是其中之一，它利用現成的化學物質為研究人員打開了一扇窗，讓其不僅可以觀察大腦，還幾乎可以觀察其他任何一個器官。

　　其中一些方法對組織進行了清除，使不透明的組織變為透明；另一些則在清除組織的基礎上將器官按比例放大，讓更多細節得以暴露在傳統顯微鏡下。具體選擇哪種方法由具體的科學問題決定。有許多不同方法可以達到類似的目的，而使用者應在決定選擇哪一種方法前研究清楚各自的優勢和局限性。

　　大腦成像——組織清除技術

　　神經科學家最早對組織清除技術產生了需求；他們因為無法追蹤大腦中軸突和樹突的蜿蜒路徑而倍感受挫。

　　通常情況下，這類研究會對標記的腦組織切片連續成像，然後藉由計算機進行三維重建。但這個過程十分緩慢：利用顯微鏡需要花上幾個星期才能成像小鼠大腦中的迴路。構建出來的圖譜完全取決於輸入數據的質量。

　　加州理工學院的神經科學家Viviana Gradinaru說：「大多數情況下，你只是對部分切片進行了採樣，因此重建效率並不高。此外，切割還會損害組織表面及邊緣，致使你無法將它們重新連接起來。」

　　另一種更好的方法是使組織透明化，然後將其完整地成像。但只有到了近幾十年，分子試劑、遺傳策略和成像技術取得了長足發展，這才成為了可能。

　　想要照亮大腦的內部，脂質是頭號公敵。當穿過水溶液的光遇到脂質表面時，折射率的變化會使其發生彎曲和散射。「想想吉露果子凍 [果凍]：它主要由蛋白質組成，而且是半透明的，」Gradinaru說，「但如果你在吉露果子凍里添加奶油，那它就不再透明了。奶油就是脂質組成的。」

　　細胞和細胞器膜主要由脂質組成，包裹軸突的髓鞘也是。對大腦組織進行清除指的就是清除這些脂質分子，但保留其餘的分子。

　　1911年，德國解剖學家Werner Spalteholz首次展示了清除不透明組織的方法，他利用化學溶劑消除了會引起光散射的生物分子。但是這種方法並不適合今天的熒光試劑，而且會對組織結構造成損害。

　　2011年，維也納科技大學的腦部影像專家Hans-Ulrich Dodt、現如今在德國慕尼黑大學的AliErtürk和德國神經退行性疾病中心的Frank Bradke描述了最早的現代組織清除技術之一。

　　該方法被稱為3DISCO，在原理上傳承了Spalteholz的方法，但使用了更溫和的化學溶劑混合物溶解脂質，同時保留細胞結構，使標本脫水和硬化成透明的框架，從而保留組織的原始結構。

　　法國國家健康與醫學研究院（INSERM）視覺研究所的發育神經科學家AlainChédotal表示：「我們認為基於溶劑的方法在可重複性和成本方面是最為可靠的。」

　　通常情況下，基於溶劑的方法通常最適合使用熒游標記的抗體作為報告分子，因為天然表達的熒光蛋白傾向於產生較弱的信號或在處理後發生變性。但Ertürk團隊對3DISCO進行了改良，進而克服了這個問題。

　　vDISCO使用染料標記的「納米抗體」來增強溶劑清除後組織中熒光蛋白的信號——該團隊就是用這種方法對小鼠的大腦進行了清理並完整成像（參見go.nature.com/2tk6hr3）。

　　另一種廣泛使用的組織清除方法是CLARITY，它是2013年Gradinaru在斯坦福大學神經科學家Karl Deisseroth的實驗室里幫助開發出來的。Deisseroth實驗室在其神經科學研究中廣泛使用熒光蛋白，並不斷尋求更「自然的」清除方法，以最大限度地減少對目標生物分子的損害。

　　CLARITY使用清潔劑來消除脂質，同時通過多聚物形成水基水凝膠來強化組織框架。Gradinaru解釋說：「所有這些單體都互相連接著，固定在蛋白質中。接著你就可以使用這種溫和的清潔劑來清除脂質了。」

　　早期的CLARITY具有一定技術難度，需要利用電場主動清洗出洗滌劑包裹著的脂質。Gradinaru隨後設計了一種更簡單的替代方案，用清潔溶液灌注動物的脈管系統，達到同樣的效果。

　　Ueda則開發了另一種CUBIC方法。CUBIC利用「親水性」化學物質將水吸入固定的樣品中，同時將溶解了的脂質推出。與CLARITY一樣，該方法在澄清樣品的同時保留了熒光蛋白的結構和功能。

　　不僅僅是大腦——組織清除技術的擴展應用

　　組織清除方法使研究人員得以探索以前無法研究的神經科學問題。例如，Chédotal正在使用3DISCO探索整個視覺系統的結構。 「從眼睛往深處去，神經節細胞輸出的信號可能會映射到30個不同的大腦部位，」他說， 「我們尚不了解這些軸突究竟是如何找到不同目標的。」

　　但組織清除方法並不僅僅適用於大腦。「令我們驚訝的是，大多數嚙齒動物器官在幾天內就變得透明，」當Gradinaru提到她開發的基於灌注的CLARITY方法時說道，「除了皮膚和骨頭，動物整個身體都被清理了。」

　　Gradinaru表示，骨骼是組織清除中的一個特殊挑戰，因為在常規清除後，骨骼中殘留的鈣仍會反射光線。不過，額外加以處理便可以解決這個問題。例如，Ueda的團隊已經證明，實驗室常用的化學品EDTA能有效地去除骨骼中的鈣。Gradinaru的團隊還開發了一種能夠對骨組織進行清除的CLARITY方法。

　　這些方法使得對完整標本進行全身成像成為可能，研究人員已將其應用於追蹤罕見的幹細胞群或腫瘤轉移灶，甚至是孕早期人類胚胎里正在發育中的脈管系統和周圍神經系統。然而，隨著標本變大，顯微鏡技術可能成為一個瓶頸。研究人員必須在研究目標和可操作性之間尋求平衡。

　　光片顯微鏡是一種廣泛使用的應對策略。「你掃描的是正在通過組織的一個光平面而非一個光點，這極大地加快了成像速度。」Deisseroth說。此外某些組織清除方法自帶物理收縮效應。在3DISCO方法中，脫水最高可以將樣品縮小至50%。「這意味著我們一次性就能夠拍攝整個人體胚胎。」Chédotal說。

　　但目前的方法也只能止步於此了。對整個人體大腦進行了組織清除之後，Chédotal能夠成像的區域只有幾個立方厘米，約佔整個大腦的1%。 「我可以讓一頭奶牛變得透明，」他說， 「但我無法對它成像，那有什麼意義呢？」

　　圖像放大——標本擴展技術

　　清除是組織成像極有價值的起點，但為了了解更精細的分子層面的內容，研究人員還需要有特別的「放大」手段。

　　傳統的光學顯微鏡無法區分間隔小於光的「衍射極限」的分子，大約是200納米——這一問題推動了技術複雜的超解析度顯微鏡的發展。麻省理工學院的神經生物學家Ed Boyden最初提議「吹大」大腦的時候的確是在開玩笑，但很快他就看到了這個想法背後的真正潛力。「細胞中的所有蛋白質都擠在一起，如果我們將它們彼此分開，也許我們可以更好地看到它們。」他說。

　　Boyden的研究小組花費了數十年時間研究水凝膠特性，這些水凝膠在水合過程中會成比例膨脹。2015年，他們發表了第一代「擴增顯微鏡」方法，他們用特殊設計的熒游標記處理樣品以識別目標靶分子，然後將其與能夠形成水凝膠基質的聚合物溶液一起孵育。這些標籤分子附著在基質上，將其相對位置鎖定。

　　最後，通過化學或酶處理將周圍組織打破，通過水合的方式使凝膠基質膨脹。膨脹之後標籤分子的相對位置仍然固定，但其距離可能是原始距離的四倍。於是，之前靠得太近的分子現在可以使用標準熒光顯微鏡來辨別了。

　　對於許多生物學家來說，這種方法看起來好得令人難以置信。華盛頓大學的生物成像研究員Joshua Vaughan回憶說：「我的第一反應是：『這太瘋狂了，怎麼可能實現？』」但Vaughan對此非常感興趣，並進行了相關嘗試——隨後設計了一種替代方法，即使用傳統的熒光蛋白或抗體，而不是專門設計的標記試劑。

　　後來的改良方法包括Boyden小組的迭代方法：通過兩輪處理實現高達20倍的放大；以及由麻省理工學院生物醫學工程師Kwanghun Chung開發的另一種方法：使生物分子變性而不是消化它們，這樣可以更好地保護內源性蛋白質和組織結構的完整性。

　　「我們使用這種方法對神經連接進行描繪，因為這種情況下我們需要保留神經纖維：一旦切斷它們，就會丟失信息。」Chung說。最重要的是，這些不同的方法還可以誘導組織清除，使研究人員可以深入觀察超大尺寸樣本。

　　Vaughan的團隊已將擴展顯微鏡用於多種標本的觀察，比如果蠅幼蟲、人類腎臟等，而其他研究人員正將其應用於臨床場景（參見「透明的腫瘤」）。

　　但是，標本在擴展前需要「嫩化」，這種適宜的「嫩化」需要反覆試驗。「人的腎臟里有一些堅韌的結締組織，」Vaughan說，「因此我們不得不持續嘗試用酶來處理它。」擴張中保持「各向同性」或者說在所有方向都具有相同性也是至關重要的。

　　但是通過謹慎操作和反覆試驗，均勻擴展是可以實現的。「我們的結果表明，失真小於5%，這與安置樣品時的失真率相近，甚至更低。」Chung說。

　　透明的腫瘤

　　隨著免疫學和遺傳學認識的不斷更新，癌症醫學正在快速發展。然而，癌症病理學依然和過去一樣，依賴於對單個腫瘤組織切片進行染色和顯微鏡觀察。日本大阪RIKEN生物系統動力學研究中心的系統生物學家上田泰己說：「這種方法非常老舊，年輕的臨床科學家對此感到有些沮喪。」

　　組織清除則提供了另一種選擇。例如在2017年，上田泰己及其同事表明，組織清除技術CUBIC比傳統的製備方法具有更高的靈敏度，使臨床醫生可以觀察更大的組織片段，從而發現那些原本可能被忽略的特徵。「有時早期癌症會被誤診。」上田泰己說，「但如果你觀察的是三維的且經過組織清除處理，那麼就會很少漏診。」

　　組織清除方法還能用於腫瘤生物學研究。斯坦福大學的神經生物學家Karl Deisseroth和瑞典卡羅琳斯卡醫學院的PerUhlén利用一種改良的3DISCO方法對腫瘤異質性有了前所未有的了解——腫瘤異質性會深刻影響治療反應。麻省理工學院的神經生物學家Ed Boyden及其團隊已經證明，組織清除技術和高解析度擴增顯微鏡有助於更準確地發現早期乳腺癌病變。

　　Boyden和Deisseroth都創立了公司以促進其技術的臨床開發。一些組織清除的實踐者已經預見到傳統方法即將終結。「我們的技術讓年輕的病理學家感到非常興奮，」上田泰己說，「這似乎是他們的未來。」

　　未來前景

　　對於資金短缺的生物學家來說，擴展顯微鏡就是福音，它既能夠實現超高解析度成像，又無需昂貴的硬體設備。「基本上任何人都可以操作它，」柏林自由大學的細胞生物學家Helge Ewers說，「任何普通的顯微鏡都可以成為超高解析度顯微鏡。」最重要的是，所需的試劑不必特殊設計，只不過需要反覆嘗試才能找到正確的配比。

　　Chédotal指出，對整隻小鼠進行組織清理大約只需花費1美元。設備要求也不高，「你只需將器官放入化學物質中，需要的設備只有孵育箱和搖床——大多數實驗室都有。」上田泰己說。

　　從技術角度說，標本擴展比純粹的組織清除要求更高，但Boyden和其他人已經發表了「最佳操作」指南，減少了研究人員使用擴增顯微鏡時不必要的摸索。「這還不完全是一本『操作步驟書』，但我們正在努力接近。」Boyden說。

　　研究人員已經開始探索如何有效利用這些方法。多個大腦圖譜項目正在進行中，其目標不僅僅是單個細胞，還有細胞之間的連接。其他科研人員正在嘗試對DNA和RNA進行清除和擴展，以深入研究基因表達和蛋白質。

　　哈佛大學的生物物理學家莊小威設計了一種基於擴展顯微鏡方法，能夠對單個細胞RNA水平上100多個基因的表達進行量化。與此同時，Deisseroth及其同事開發了一種名為STARmap的技術，可以在經過組織清除後的大腦中對1，020個不同的基因進行直接測序。

　　這些方法得到的數據可以用於識別單個細胞。但也可以與迴路圖、活體動物實驗相結合，揭示大腦內部結構和功能的相互關係以及那些從前未被發現的連接。

　　「因為保留了組織中細胞的三維位置，我們應該能夠記錄細胞層面的轉錄組學數據、連接組學數據以及實時收集的活體動物細胞層面的活動模式。」Deisseroth說， 「組織清除能夠讓人將這些完全不同的數據綜合起來。」

　　原文以Transparent tissues bring cells into focus for microscopy為標題

　　發布在2018年12月4日的《自然》技術特寫上

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