於文強教授團隊開發了全基因組DNA甲基化檢測新方法，揭示腫瘤發生和轉移新機制

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隨著人類基因組計劃的完成，生命科學研究進入了「後基因組時代」，而表觀遺傳學是「後基因組時代」的前沿方向。DNA甲基化是表觀遺傳學的核心組成部分，對於正常細胞功能維持、胚胎髮育等生命過程至關重要，DNA甲基化紊亂與腫瘤的發生和轉移具有密切關係。因此，進行全基因組DNA甲基化的檢測和分析對於探索腫瘤的發生髮展、轉移和複發機制以及開發新的抗腫瘤策略具有重要意義。

近日，復旦大學附屬上海市公共衛生臨床中心、生物醫學研究院雙聘教授於文強團隊開發了具有自主知識產權的全基因組 DNA 甲基化檢測技術——導向定位測序（Guide Positioning Sequencing，GPS）。相比於 WGBS，GPS 具有覆蓋率高（高達96%）、可覆蓋GC-rich區域和重複序列區域。

利用 GPS對正常肝細胞和肝癌細胞進行全基因甲基化測序，分析發現基因體（gene body）和啟動子之間的甲基化差異（methylation of genebody difference to promoter，MeGDP）可有效地預測基因表達，啟動子和增強子中的「甲基化邊界移動（Methylation Boundary Shift，MBS）」能夠調控與免疫和腫瘤代謝相關的基因的表達，異常的 DNA 甲基化參與了組織特異性的增強子轉換，進而導致細胞身份的轉變和肝癌發生髮展以及肝癌的特異性肺轉移，相關研究於2019年1月22日發表在線發表於Genome Research上。

GPS可同時獲得樣本的基因組和表觀基因組信息，一舉兩得。目前全基因組 DNA 甲基化檢測的「金標準」為重亞硫酸鹽測序（Bisulfite-sequencing），結合二代測序，能夠以單鹼基解析度檢測全基因組範圍的 DNA 甲基化。然而，重亞硫酸鹽測序的生物信息學分析固有的缺陷造成測序的不準確性和高昂的測序成本。於文強教授團隊歷時八年，開發了一套新的全基因組 DNA 甲基化檢測技術——導向定位測序（Guide Positioning Sequencing，GPS）。

相比於目前最廣泛使用的 WGBS，GPS 具有以下優點: 1.單鹼基解析度的全基因組DNA甲基化位點檢測；2.能夠區分DNA模板正負鏈甲基化； 3. 能夠覆蓋基因組幾乎所有重複片段；4. 檢測費用大幅下降； 5.GPS可以同時檢測基因組和表觀基因組信息。應用 GPS 檢測正常肝細胞以及兩個肝癌細胞系 97L 和 LM3 中全基因組 DNA 甲基化發現，在人類正常肝細胞中，GPS 對 CpG 位點覆蓋率達 97%，胞嘧啶的覆蓋率達 96%；在肝癌細胞系 97L 細胞中，GPS的比對率為 80.9%，比 WGBS 的覆蓋率高 15～20%。

MeGDP實現了通過DNA甲基化對基因表達的成功預測。啟動子區域的DNA甲基化與基因的表達沉默有關，但從全基因組水平來看，啟動子區域的DNA甲基化與基因表達沒有關係。通過對GPS檢測數據的分析，我們發現基因體和啟動子區域的 DNA 甲基化差異與基因表達之間存在很強的相關性，並將基因體和啟動子區域的 DNA 甲基化差異定義為 MeGDP（methylation of gene body differenceto promoter）。

MeGDP 與基因表達之間的相關係數Rho 高達 0.67，提示 MeGDP 可以做為基因表達的預測因子。在肝癌細胞中，MeGDP 降低與免疫系統以及代謝紊亂相關。這些結果提示，在腫瘤發展過程中，腫瘤細胞自身內源性的免疫相關的分子通過 DNA 甲基化沉默可能是腫瘤細胞免疫逃逸的重要原因。

MBS，DNA甲基化調控基因表達的新模式。我們經常會遇到即使啟動子的區域DNA低甲基化，但基因表達水平還是不同。我們通過分析啟動子區域的DNA低甲基化區域的寬度，發現相比於正常肝細胞而言，腫瘤細胞可能在啟動子區域有更寬的低甲基化。

我們將轉錄起始位點附近的 DNA 甲基化邊界變化命名為「甲基化邊界漂移「，即MBS（MethylationBoundary Shift，MBS）」。進一步研究發現，MBS向TSS下游的延伸與基因的高表達有關，而這些高表達的基因與核糖體基因的合成和細胞周期相關，而這些基因無疑與腫瘤密切相關。

增強子做為重要的順式調控原件，同樣受到MBS的調控。與正常肝細胞相比，研究發現 97L 細胞通過MBS改變了增強子的狀態，導致腫瘤細胞中增強子的獲得或丟失，而增強子區域的異常 DNA 甲基化模式可能調改變強子特性以及所調控的基因表達，賦予腫瘤細胞新的特性，繼而與腫瘤的發生髮展和轉移有關。

「同化共生」，腫瘤轉移的新機制。物以類聚，人以群分，腫瘤的發生和轉移也一樣。腫瘤轉移是腫瘤治療失敗的重要原因之一，而腫瘤特異性的器官轉移機制並不清楚。例如肝癌容易發生肺轉移，我們通過分析肝癌細胞97L和肝癌特異性轉移到肺的LM3細胞的DNA甲基化模式和基因表達情況，發現肝細胞特異性的基因表達降低，而肺細胞特異性的基因表達上調提示肝細胞身份丟失和肺細胞身份的獲得是肝癌發生肺轉移的重要原因。

我們的結果表明，在97L 和 LM3 肝癌細胞系中，肝特異性高表達的基因的數目分別降低了 74% 和 80%；而肺特異性CKS2 在 97L 和 LM3 中的表達升高，與此同時，在肝癌細胞中的肝特異性增強子減少和肺特異性的增強子增加與 DNA 甲基化異常模式相關。我們認為增強子區域異常的 DNA 甲基化異常模式可以調控增強子的漂移並影響相關靶基因的表達。

我們認為腫瘤細胞通過改變身份，與特異性轉移的器官組織細胞通過表觀遺傳學的機制，進而「同化共生「，肝癌細胞中表達的肺特異性的基因可以幫助肝癌細胞更好地適應肺環境，提示腫瘤細胞身份的丟失以及其他細胞身份的獲得是腫瘤發生和轉移的重要原因，而同化共生可能是腫瘤發生特異性器官轉移的重要分子機制。

復旦大學生物醫學研究院博士李晉、李岩，助理研究員李偉，博士羅懷兵，博士後奚艷萍，博士生董世華，國防科技大學博士高明為本文共同第一作者，復旦大學附屬上海市公共衛生臨床中心、生物醫學研究院於文強研究員，生物醫學研究院吳飛珍助理研究員以及國防科技大學彭邵亮教授為本文共同通訊作者。本研究得到了科技部、上海市科委基礎研究重大專項、上海市「科技創新行動計劃」、國家自然科學基金、國家「863」計劃等經費的支持。

來源：上海市公共衛生臨床中心科研部

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