施一公等在《細胞》發文報道酵母B*剪接體電鏡結構

最新 03-15

　　來源：結構生物學高精尖創新中心

　　2019年3月15日，清華大學結構生物學高精尖創新中心施一公研究組就剪接體的機理與結構研究，於《細胞》（Cell）雜誌發表題為《催化激活狀態的酵母剪接體結構揭示RNA剪接分支反應的機理》（Structures of the Catalytically Activated Yeast Spliceosome Reveal the Mechanism of Branching）的科研論文，揭示了剪接體第一步剪接反應前的瞬變狀態——催化激活剪接體（catalytically activated spliceosome，定義為「B*複合物」）4個不同構象的高解析度三維結構，這是目前RNA剪接循環中最後一個未被解析的基本狀態。至此，施一公研究組成為世界上首個、也是唯一一個成功捕獲並解析了RNA剪接過程中所有完全組裝剪接體高解析度三維結構系列成果的團隊。該文報道的這4個同一狀態卻不同構象的剪接體結構，整體解析度為2.9埃-3.8埃，核心區域的解析度高達2.7埃，是目前報道的最高解析度剪接體結構，該結構首次揭示了第一步剪接反應發生過程中的動態變化，展現了剪接因子對於剪接反應發生的重要作用，第一次從結構信息中回答了剪接體對不同pre-mRNA底物識別的特異性等重要科學問題。

　　1977年，科學家們首次發現來自於腺病毒的mRNA與其對應的DNA轉錄模板並不能形成連續的雜交雙鏈，而是在雜交雙鏈的不同位置伸出了環狀的DNA單鏈。這個重大發現表明，遺傳信息從DNA傳遞到mRNA上並不只是通過轉錄，還需要pre-mRNA剪接來進一步完成「無效」遺傳信息的去除與有效遺傳信息的拼接。「無效」的遺傳信息不具有翻譯功能，被稱為內含子，而可以被核糖體翻譯的有效遺傳信息叫做外顯子，內含子被去除、外顯子被連接這一過程即為RNA剪接。RNA剪接普遍存在於真核生物中，隨著物種的進化，含有內含子的基因數量增加，發生RNA剪接的頻率也相應增高，使得一個基因編碼多個蛋白質成為可能，極大的豐富了蛋白質組的多樣性，也是真核生物多樣性的重要原因之一。

　　RNA剪接是真核生物基因表達調控的重要環節之一，其化學本質是兩步轉酯反應。這種看似簡單的化學反應在細胞中難以自行發生，而負責執行這一化學反應的是細胞核內一個巨大且高度動態變化的分子機器——剪接體（spliceosome）。從1977年首次發現RNA剪接至本世紀初，科學家們通過免疫沉澱、基因敲除、交聯質譜、建立體外剪接反應系統等研究手段，初步建立起剪接體的組裝、激活與解聚的發生過程，以及蛋白與蛋白、蛋白與核酸之間的相互作用、相互調控等複雜的RNA剪接調控網路。在剪接反應過程中，多種蛋白-核酸複合物及剪接因子按照高度精確的順序發生結合、重排和解聚，依次形成預組裝複合物U4/U6.U5 Tri-snRNP（U4/U6.U5三小核核糖核蛋白複合物）以及至少8個狀態的完全組裝剪接體pre-B、B、Bact、B*、C、C*、P以及ILS複合物（圖1）。

圖1 RNA剪接示意圖（圖片來源: Yan, C., Wan, R., & Shi, Y. (2019).Cold Spring Harbor perspectives in biology, 11(1), a032409.）

　　由於剪接體高度的動態性和複雜性，獲得不同狀態的剪接體的高解析度三維結構被公認為世界難題。在這種巨大的挑戰下，施一公教授率領研究組迎難而上，經過7年的努力，終於在2015年首次報道了裂殖酵母剪接體3.6埃的高解析度結構，首次展示了剪接體催化中心近原子解析度的結構。這一重大研究成果對RNA剪接機理的研究產生革命性影響。自2015年第一個剪接體結構發表以後，施一公研究組相繼解析了釀酒酵母剪接體複合物處於8個不同狀態的高解析度結構，分別是3.8埃的預組裝複合物U4/U6.U5 Tri-snRNP、3.3埃-4.6埃的預催化剪接體前體pre-B complex、3.9埃的預催化剪接體B complex、3.5埃的激活狀態剪接體Bact complex、3.4埃的第一步催化反應後剪接體C complex、4.0埃的第二步催化激活剪接體C* complex、3.6埃的完成兩步轉酯反應後的剪接體P complex，以及3.5埃的內含子套索剪接體ILS complex的結構。這些已解析的剪接體基本覆蓋了整個RNA剪接循環，從分子層面揭示了剪接體催化RNA剪接兩步反應的工作機理，同時為理解剪接體的組裝、激活和解聚等過程的發生提供結構依據。然而，最後一個未被解析的完全組裝剪接體B* complex，對於理解第一步剪接反應的發生具有至關重要的作用。由於其高度的動態性與瞬時性，如何捕獲B* complex成為領域內的一大難題，也是世界上不同課題組爭先解決的問題之一，捕獲並解析其結構迫在眉睫。

　　儘管之前積累了大量剪接體結構研究的經驗，施一公研究組在針對如何捕獲穩定的B* complex時，卻是舉步維艱，困難重重。由於B* complex和C complex是第一步剪接反應發生時一前一後的兩個狀態，領域內對其鑒定的核心區別在於5』剪接位點與分支點之間的磷酸二脂鍵是否形成。因此，在不影響剪接體正常組裝和激活的前提下，如何阻止第一步反應發生，並且保持5』剪接位點與分支點已經進入RNA剪接的活性反應中心，並形成反應前的活性位點，成為本文研究的最大難點。施一公研究組分別進行了體內內源直接阻斷和體外建立剪接反應阻斷等方法的嘗試，最終都無法獲得穩定的B* complex樣品。在最新發表的這篇《細胞》文章中，施一公研究組將體內阻斷與體外建立剪接反應相結合，對提純方案多次探索，最終優化出一套可以獲得穩定的、性質良好的B* complex樣品。為了探索剪接體對不同pre-mRNA底物的識別特異性，施一公研究組選取了領域內常用的兩種pre-mRNA作為剪接體結合的底物，隨後利用單顆粒冷凍電鏡技術重構出了4個不同構象B* complex整體解析度為2.9埃-3.8埃的冷凍電鏡結構，並搭建了原子模型，其中包含了4條RNA和35個蛋白（圖2）。

圖2 釀酒酵母催化激活剪接體4個構象的三維結構

　　該文解析的4個不同構象的B* complex結構，首次展示了RNA剪接第一步反應發生過程中分支點如何被剪接體逐步「推入」活性反應中心的動態變化，其中第一步剪接因子Yju2在穩定分支點中發揮了舉足輕重的作用，儘管此時5』剪接位點與分支點的距離十分接近（4.3埃），卻不足以形成磷酸二脂鍵。從而，該結構也清晰地揭示了關鍵蛋白因子Cwc25在激發第一步剪接反應中的重要作用（圖3）。值得一提的是，在這個結構中，第一次觀察到了pre-mRNA中分支點A被5』剪接位點GU通過經典的鹼基互補配對以及鹼基堆積力共同識別的機制，這個結構信息進一步證明了該位點在真核生物中高度保守的重要性。本文另一大亮點是首次揭示了剪接體對不同pre-mRNA底物識別的特異性，為體內不同pre-mRNA的剪接效率存在差異提供了最直接的結構信息。

圖3 釀酒酵母剪接體介導分支反應的模型

　　截至目前，施一公研究組在酵母中一共解析了10個不同狀態的剪接體高分辨的三維結構（如圖4），成果全部發表於國際頂級期刊《科學》和《細胞》（Science 7篇，Cell 3篇），從組裝到被激活，從發生兩步轉酯反應發生到剪接體的解聚，這10個狀態的剪接體完整覆蓋了剪接通路，首次將剪接體介導的RNA剪接過程完整的串聯起來，為理解RNA剪接的分子機理提供了最清晰、最全面的結構信息。

圖4 施一公研究組解析的酵母剪接體結構匯總（圖片來源: https://ygshi.org/research）

　　十年一劍！施一公實驗室就剪接體結構研究揭示RNA剪接分子機理

　　清華大學結構生物學高精尖創新中心主任施一公教授為本文的通訊作者；清華大學醫學院博士後、高精尖創新中心卓越學者萬蕊雪、生命學院四年級博士研究生白蕊為該文的共同第一作者，清華大學生命學院博士後、高精尖創新中心卓越學者閆創業為結構模型的搭建提供了幫助；清華大學冷凍電鏡平台主管雷建林博士為冷凍電鏡數據收集提供了幫助。電鏡數據採集於清華大學冷凍電鏡平台，計算工作得到清華大學高性能計算平台、國家蛋白質設施實驗技術中心（北京）的支持。本工作獲得了北京結構生物學高精尖創新中心（清華）及國家自然科學基金委的經費支持。

　　原文鏈接

　　https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30155-2

　　相關論文鏈接

　　http://science.sciencemag.org/content/early/2016/01/06/science.aad6466

　　http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac8159

　　http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac7629

　　http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag0291

　　http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag2235

　　http://science.sciencemag.org/content/early/2016/12/14/science.aak9979.full

　　http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30954-6

　　http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)31264-3

　　http://science.sciencemag.org/content/early/2018/05/23/science.aau0325