人類繁衍的秘密：生殖幹細胞
對於物種而言，種群中每個個體生命都是有限的。為了保證種群的延續，多數高等動物採用精卵結合有性生殖方式繁衍後代，維持族群。是負責繁衍後代的幹細胞：生殖幹細胞。
自然界中，大多數高等動物新生命的開始都源於父親精子和母親卵子的結合。精卵細胞結合形成一個受精卵，新生命就這樣誕生了。在生殖過程中，單倍體生殖細胞（精子和卵細胞）負責將父代、母代遺傳信息傳遞給子代。
精子和卵子的各自起始細胞，便為生殖幹細胞。作為成體幹細胞的一種，生殖幹細胞具有自我更新能力和向生殖細胞分化的能力，在維持自身數量的同時，不斷產生分化的生殖細胞，經過減數分裂形成配子。
研究顯示，哺乳動物雄性生殖幹細胞只佔生殖細胞總數的0.02-0.03%，但這萬分之一左右的細胞，卻肩負著重要的任務，需要在一生的時間裡產生成千上萬的精子[1]。正常男性一生大概能產生超過9520億成熟精子[1]。
而在雌性哺乳動物中，正常雌性一生只能產生相對稀少的數目的成熟卵子。如正常女性，一生中只能產生300-500顆成熟卵子。這是否意味著，雌性卵巢中不存在生殖幹細胞，或者說生殖幹細胞數量極其稀少呢？
1、生殖幹細胞的起源
要想全面了解「生殖幹細胞 」，我們先把雌性生殖幹細胞的世紀爭論先放一放。先看一看，雄性和雌性生殖細胞，最初的來源是哪裡？
生殖幹細胞，你來自哪裡？
我們先從小鼠胚胎髮育開始，隨後介紹人類胚胎髮育，去看生殖細胞的起源。
1）胚胎時期的生殖細胞
在小鼠胚胎髮育過程中，在E7天原腸胚時期開始出現生殖細胞的祖細胞：原始生殖細胞PGC（Primordian Germ Cell）。
E7天是什麼意思？就是指胚胎髮育的第七天，從受精卵形成開始計時。大家都聽說過大名鼎鼎的胚胎幹細胞，其具有多能性，能分化成各種類型的細胞，這個大佬就是在E3.5天的囊胚期存在於囊胚內細胞團ICM中。
PGC通過細胞遷移，長途跋涉，E10.5到達胚胎的生殖脊，在此過程中PGC數目逐漸增多，在生殖脊部位定植下來，隨後分化為生殖細胞：雄性胚胎中變成精原細胞，雌性胚胎中則形成卵原細胞。
生殖脊經過分化、發育，最終形成雄性性腺睾丸和雌性性腺卵巢，而PGC最終變成了性腺部位的生殖細胞。
一句話，一切生殖細胞包括生殖幹細胞都是來源於胚胎時期的原始生殖細胞PGC。
圖一：小鼠原始生殖細胞PGC（褐色細胞）在胚胎中的分布變化
原始生殖細胞在胚胎髮育時期，從最初的外胚層（epiblast）經過背系膜(dorsal mesentery)，最終到達生殖脊（genitarridge）引自Jae Yong Han:…genome editing in birds.」
2）出生後的生殖細胞
那麼，胚胎在出生前夜，其精原細胞、卵原細胞會只是安靜待在自己的位置睡個大覺么？
卵原細胞不是的，她非常勤奮。雌性小鼠出生（E20）前夜，卵原細胞大量增殖，會進行減數分裂，形成初級卵母細胞。小鼠在出生前形成生千個初級卵母細胞，而女性則達到了百萬數量級別，而這些卵母細胞只是停留在第一次減數分裂的雙線期，且大部分會在出生後發生程序化死亡。
出生後，睾丸和卵巢還會繼續發育。
在睾丸中精原細胞逐步分化，在性成熟時便開始進行精子發生，通過減數分裂和有序分化，依次形成形成初級精母細胞、次級精母細胞、圓形精子，最終圓形精子形成 「蝌蚪形」成熟的精子，形成生殖能力。
卵巢在性成熟時，卵母細胞已經進入到第二次減數分裂，形成了次級卵母細胞，最後通過排卵，進入輸卵管，形成生殖能力。
與雌性小鼠卵巢發育過程類似，人類女性出生時卵巢中大約有200萬個卵泡（一個卵母細胞+N個顆粒細胞形成一個卵泡），到青春期時則只剩下約30萬個。數量貌似巨大，但是正常女性一生大概有約300-500個卵泡可以發育成熟並排卵。
圖二、哺乳動物卵巢結構示意圖
卵巢中卵細胞與顆粒細胞組成卵泡結構，在排卵周期中，首先原始卵泡（Primordial follicles）發育成初級卵泡（Primaryfollicles）、次級卵泡（Secondary follicles），在形成囊狀卵泡（Vesicularfollicle）後，卵細胞脫離卵泡結構，排出卵巢，剩下的卵泡結構逐漸萎縮形成黃體（Corpus luteum）（引自KevinCoward：Mammalian reproductive physiology）
2、尋找你心中的生殖幹細胞
在哺乳動物的生殖器官里，充滿了各種大同小異的細胞，那麼如何從茫茫細胞海洋中得知哪些細胞是生殖幹細胞幹細胞，哪些細胞不是呢？
開啟尋找生殖幹細胞之旅
1）雄性生殖幹細胞的發現
傳統觀念認為，出生時精原細胞數量是確定的。如果沒有一種生殖幹細胞來提供精原細胞，導致精原細胞枯竭，那麼男性產生精子的能力會迅速消失。
但事實卻不是這樣，剛才提到，男性一生中能產生超過5250億成熟精子，具有持續產生精子的能力。那麼睾丸中必然存在著這麼一種細胞，不斷補充精子產生所損耗的精原細胞。這種細胞符合幹細胞的標準，即必然存在著雄性生殖幹細胞，一方面不斷分化補充精原細胞以供精子發生，一方面也不斷自我更新，維持自身數目，以避免幹細胞資源枯竭。
我們知道，哺乳動物睾丸中彎曲盤旋著大量曲細精管，一個成年人所有曲細精管長度加起來可達260米。這些曲細精管負責精子的產生，成熟後的精子可以通過輸精管排出體外。
那麼曲細精管的哪個位置，駐紮著幹細胞呢？
小鼠性成熟時，睾丸曲細精管則為「中空」結構，包含有處於各種分化時期的生殖細胞：如生殖幹細胞、精原細胞、精母細胞等，在管中心附近聚集大量成熟精子，而雄性生殖幹細胞則位於管壁附近（圖二和圖三）。
圖三、哺乳動物睾丸、曲細精管結構及精子形成過程示意圖
睾丸(testis)中存在著大量曲細精管（seminiferous tubule），在曲線精管管壁由外向管中心分別分布著支持細胞（sertoli cell）、精原細胞（germinal cell orspermatogonia cell）、初級精母細胞（primary spermatocyte）、次級精母細胞（secondary spermatocytes）、圓形精子(spermatids)和成熟精子(spermatozoa)
那麼雄性生殖幹細胞如何發現的呢？
最早在1994年美國人Brinster RL教授首次將小鼠精原細胞（包含有生殖幹細胞）注射到無生精能力的小鼠睾丸曲細精管中，使小鼠恢復了生殖能力，首次通過試驗證明了小鼠雄性生殖幹細胞的存在。隨後大量的研究工作，實現了體外分離培養雄性生殖幹細胞，並找到了一些標記物如PLZF，來識別體內的雄性生殖幹細胞。如下圖，就利用Stell4蛋白來標記出了小鼠的雄性生殖幹細胞（圖三，綠色細胞為生殖幹細胞）。
圖四、新生小鼠雄性生殖幹細胞定位：綠色細胞為Sall4+雄性生殖幹細胞
藍色為細胞核，外圈紅色為支持細胞sertoli，顯示雄性生殖幹細胞位於支持細胞所處的曲細精管外壁附近
人類睾丸曲細精管結構和幹細胞定位模式與小鼠類似。但人類雄性生殖幹細胞分離後在體外進行長期培養直到2009才成功[4]。
所以，我們可以看出在成體雄性睾丸中，生殖幹細胞位於曲細精管外壁附近，且數量稀少，但功能及其強大：如男性的生殖幹細胞需要承擔起產生超過5250億成熟精子的任務。
2）雌性生殖幹細胞的發現
傳統觀念依然認為，雌性哺乳動物卵細胞數目在個體出生時，便已確定，不會更新增加，在性成熟後隨著不斷排卵，不斷減少，如正常女性一生中只能產生300-500顆成熟卵子。
這是否意味著，出生後的哺乳動物卵巢中無生殖幹細胞存在，使得卵細胞最終走向枯竭，使得女性生育年齡受限在16-50歲。
圖：卵細胞的形成過程
而近期的研究結果正在挑戰這一傳統觀念， 證明出生後卵巢中仍然存在著雌性生殖幹細胞，支持著卵細胞更新 。
最先發起這一挑戰的是Jonathan Tilly和吳際教授。
2004年，Jonathan Tilly教授在哈佛醫學院任職期間，發現了成年小鼠卵巢中存在著旺盛分裂的生殖細胞，且通過統計卵巢卵泡數目的變化，證明成年後卵細胞更新仍然存在[5]。這是科學界第一次拿出哺乳動物卵巢生殖幹細胞存在的證據。
在2009年，Nature Cell Biology雜誌發表上海交通大學吳際教授研究成果。通過磁珠分選技術，成功從小鼠卵巢中分離出雌性生殖幹細胞，此幹細胞能在體外穩定培養並傳代，且通過移植實驗，將幹細胞移植到無卵泡發生能力的小鼠卵巢後，使受體鼠生育能力恢復，證明了該細胞具有向卵細胞分化的能力[6]。
Jonathan Tilly和吳際教授的工作第一次將小鼠卵巢生殖幹細胞進行了定位：卵巢皮質表面（圖五）。
圖五、雌性生殖幹細胞定點陣圖
利用免疫組化（MVH信號）和免疫熒光（MVH綠色信號、BrdU紅色信號）將小鼠卵巢雌性生殖幹細胞進行定位，顯示其存在於皮質區
在2012年，Jonathan Tilly教授則利用類似的流式分選技術，從人卵巢中分離得到了能進行有絲分裂，且具有卵細胞分化能力的生殖幹細胞。
其後，越來越多的研究者從大鼠、豬等哺乳動物中分離得到了雌性生殖幹細胞，越來越多的證據支持哺乳動物雌性生殖幹細胞的存在。
3、生殖幹細胞，未來可期
目前根據中國人口協會12年的《中國不孕不育現狀調研報告》，保守估計全國不孕不育的人數已經高達4000萬，占育齡人口的12.5%，即每8對夫婦中就有1對有不孕不育問題，北上廣等一線城市甚至達到15%以上。
圖六、不孕不育年齡及性別比率統計 （引自《中國不孕不育現狀調研報告》）
那麼，很多人就在想，通過雄性生殖幹細胞的研究，是否能解決男性不育問題的方法？ 或者通過雌性生殖幹細胞的研究，是否能找到延長女性生育時間、延緩女性卵巢衰老的好辦法？或者說找到解決女性不孕問題的方法？
筆者只能說，前景可期：生殖幹細胞的研究，或許是解決這些問題的鑰匙之一。
1）產前篩查
如利用生殖幹細胞鑒定與不孕不育相關的基因突變，為產前篩查提供參考。 已有資料顯示，在男性不育方面，遺傳因素導致的不育佔比為4%。單基因/多基因突變或者染色體畸變通過影響精原幹細胞功能或者微環境（niche）變化，最終導致幹細胞缺失或精子發生受阻[7]。
2）藥物開發
如利用生殖幹細胞研究與生殖細胞分化、增殖的關鍵通路，為藥物設計提供靶點。 利用靶標藥物，對幹細胞相關通路進行抑制或者激活，加強人體生精的功能、排卵功能，治療弱精子症、少精子症等。
3）細胞儲存
或者提供生殖幹細胞的儲存服務，為高危輻射環境工作人員、化療和放療患者等提供幹細胞提取、擴增和儲存方案，保護其生育能力。
總的來說，現實很殘酷，但未來可能很美好。隨著幹細胞技術的發展，相信生殖幹細胞能更多地造福於人類。
希望 早日實現 From bench to beside 。
參考文獻：
1 Sharma S, Wistuba J, Pock T, et al.Spermatogonial stem cells: updates from specification to clinical relevance[J].Human reproduction update, 2019.
2 Han J Y, Park Y H. Primordial germcell-mediated transgenesis and genome editing in birds[J]. Journal of animalscience and biotechnology, 2018, 9(1): 19.
3 NegusN C, Berger P J. Mammalian reproductive physiology[M]//Current mammalogy.Springer, Boston, MA, 1987: 149-173.
4 Sadri-ArdekaniH, Mizrak S C, van Daalen S K M, et al. Propagation of human spermatogonialstem cells in vitro[J]. Jama, 2009, 302(19): 2127-2134.
5 JohnsonJ, Canning J, Kaneko T, et al. Germline stem cells and follicular renewal inthe postnatal mammalian ovary[J]. Nature, 2004, 428(6979): 145.
6 Zou K,Yuan Z, Yang Z, et al. Production of offspring from a germline stem cell linederived from neonatal ovaries[J]. Nature cell biology, 2009, 11(5): 631.
7 SharmaS, Wistuba J, Pock T, et al. Spermatogonial stem cells: updates fromspecification to clinical relevance[J]. Human reproduction update, 2019.
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