轉錄組複雜性和胞漿蛋白穩態應激在卵巢腫瘤形成過程中的作用

研究背景

上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer，EOC）是常見的婦科惡性腫瘤，其標誌是早期轉移性傳播和普遍的基因組變異。其中大規模拷貝數改變在 EOC 中佔主導地位，導致基因表達異常和轉錄依賴性。因此，更徹底地描述腫瘤基因組和轉錄組學特徵有望為提出卵巢癌的新治療策略提供幫助。二代測序由於 PCR 擴增和片段化的步驟會引入偏好性和錯誤，通常無法準確的解析轉錄起始位點，剪接位點，多聚腺苷酸化位點和基因融合事件等轉錄本結構信息。三代 SMRT 測序的超長讀長可完整跨越整個轉錄本，從而避免了轉錄本的組裝，可以提供全長轉錄本的準確結構信息。

研究方法

1. 樣本選擇：上皮性卵巢癌患者的正常卵巢組織，原發性腫瘤，遠端轉移瘤，血液對照。

2. 測序策略：Pacific Biosciences RS II 平台：全長轉錄組測序，分片段建庫，每個樣本共測6個 SMRT cells；Illumina HiSeq X：全基因組測序（50X）和轉錄組測序。

研究結果

1. 轉移性卵巢癌的整合遺傳和功能分析

利用綜合分析結合深度測序和細胞實驗系統地描述臨床病例的基因組，轉錄組和功能特性（圖1a）。Illumina HiSeq X 系統上運行全基因組測序和轉錄組測序，Pacific Biosciences RS II 平台上運行全長 RNA 測序。整合每種測序策略的結果以鑒定腫瘤特異性畸變，包括核苷酸突變，拷貝數變化，轉錄組變異和差異基因表達。同時，使用基於成像的高通量藥物篩選和細胞增殖檢測進行功能分析，以確定針對卵巢腫瘤細胞的有效治療方式（圖1b）。

圖1 轉移性卵巢癌的整合遺傳和功能分析

2. 全基因組突變圖譜和異常調節基因的表達譜

分別從原發性和轉移性腫瘤中檢測到7,053和6,852個體細胞突變，包括總共50個和47個非同義外顯子替換，KRASG12R 和 FGFR2T14I 被鑒定為驅動突變（圖2a）。基因組變異（圖2b），突變頻譜和基於 SNV 的突變特徵（圖2c）在原發瘤和轉移瘤中非常相似。

圖2 原發瘤和轉移瘤的全基因組突變圖譜

相對於正常卵巢組織，癌症驅動基因 KRAS 和 FGFR2 的轉錄水平在惡性腫瘤組織中均升高（圖3e）。差異表達的轉錄本的基因集富集分析（GSEA）精確定位了 KRAS 和 AKT 致癌特徵基因集上調。這些結果表明，基於二代測序基因表達量的分析，原發性和轉移性卵巢腫瘤在很大程度上表現為表型相似，與相同的驅動基因突變一致。

圖3 基因表達的聚類分析和 GSEA 富集分析

3. 全長轉錄組和分子進化

三代全長測序鑒定了58,410個獨特的轉錄物（正常：24,150；腫瘤：28,581；轉移：21,962）（圖4a），其中13.4%，78.8%和7.8%分別為已知轉錄本，已知基因的新轉錄本和未注釋的新基因。Ensembl 注釋中的12,180個編碼基因（圖4b）和8,885個 lncRNA（圖4c）被 PacBio SMRT 測序覆蓋。另外，檢測到6,086個可變轉錄起始位點（ATSS），9,112個可變剪接事件（AS），12,061個可變多聚腺苷酸化（APA）和489個融合轉錄本。廣泛的轉錄調控（ATSS 和 AS）可能比基因組（融合）或轉錄後調控（APA）更顯著地促成轉錄本的多樣性。

圖4 全長轉錄組測序檢測轉錄本的結構信息

利用基因組（圖2a）和轉錄組學信息（圖5h），進行系統發育重建，來評估從原發瘤到轉移瘤的進化軌跡。SNV 存在顯著的時間差異，表明了基因型發生分化（圖5i）。相對於 SNV 的差異，ATSS，AS，APA或融合轉錄本在兩個樣品之間明顯發生更大比例的差異，這與癌細胞傳播相關的早期功能改變相一致（圖5j）。

圖5 原發瘤和轉移瘤的分子進化

4. 異常的基因產物和蛋白穩態應激

基因轉錄本的數量與樣品中可變轉錄事件的數量呈正相關；與單轉錄本基因相比，多轉錄本基因顯示出更高的表達水平（圖6b）；轉錄組的高頻變異位點（ATSS，AS 和 APA 位點）產生的轉錄本中參與蛋白質摺疊和響應拓撲學錯誤摺疊蛋白的基因在原發性腫瘤和轉移瘤中富集（圖6c），表明蛋白質組學不穩定性對卵巢發病機制存在功能性影響。此外，蛋白毒性應激響應的的子集中包含差異表達的轉錄本，選擇蛋白穩態調節因子進行詳細分析，確認其在轉錄本水平上經常以多種方式變化（圖6f）；最後鑒定了參與蛋白質穩態應激調節的基因和轉錄組變異（圖6g）。

圖6 異常的基因產物和蛋白穩態應激

5. 蛋白穩態的靶向治療可以抑制卵巢癌

為了進一步驗證靶向蛋白穩態作為卵巢癌的治療選擇，將在藥物篩選中找到的靶向藥物應用到19種不同的 EOC 細胞系，並評估了硼替佐米和伊沙唑兩種蛋白酶體抑製劑的細胞毒性。兩種藥物一致顯示出對抑制卵巢癌細胞有明顯的效果，表明通過藥物干擾細胞蛋白穩態可能是控制卵巢癌的有效策略。

圖7 蛋白穩態的靶向治療抑制卵巢癌細胞

本文表明混合二代和三代測序技術在臨床腫瘤學研究的獨特能力，通過這種方法，揭示了作為易感特徵的蛋白質穩態應激，並驗證了蛋白酶體抑製劑對 EOC 的臨床有效性。該方法可應用於更大的患者群組和各種其他腫瘤類型的研究，將有望促進對腫瘤疾病的生物學理解和個性化癌症醫學研究。

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參考文獻

[1] Jing Y, Zhang Y, Zhu H, et al. Hybrid sequencing-based personal full-length transcriptomic analysis implicates proteostatic stress in metastatic ovarian cancer[J]. Oncogene, 2019, doi: 10.1038/s41388-018-0644-y.

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